異氟醚后處理誘導(dǎo)Slit-Robo信號(hào)表達(dá)抑制氧糖剝奪大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的研究.pdf

1、背景：研究表明腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元死亡通過凋亡和壞死兩種途徑。延遲性的細(xì)胞死亡既凋亡是腦缺血再灌注后神經(jīng)元死亡的重要方式。腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生機(jī)制與凋亡相關(guān)基因被激活、被調(diào)控后細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被啟動(dòng)有關(guān)。闡明腦缺血再灌注后神經(jīng)元發(fā)生凋亡的機(jī)制以及尋找藥物有效阻斷腦缺血再灌注后凋亡的發(fā)生、發(fā)展是一項(xiàng)迫切而又有意義的工作。
　　 Slit作為一種分泌性的多肽蛋白，在軸突的排斥性引導(dǎo)和神經(jīng)元的遷移中發(fā)揮著重要作用

2、。同時(shí)還有研究表明，Slit參與了白細(xì)胞的趨化排斥作用，抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，這種保守的排斥作用可以作用在多種細(xì)胞中。最近有文章報(bào)道Slit對(duì)腦缺血再灌注的大鼠模型以及混合培養(yǎng)的神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪模型具有保護(hù)作用，可以減少神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
　　 已有研究證明吸入性麻醉藥異氟醚具有腦保護(hù)作用，減少腦缺血再灌注后神經(jīng)元的凋亡。公認(rèn)的吸入性麻醉藥異氟醚，其腦保護(hù)機(jī)制與降低缺血后腦組織的代謝和擴(kuò)張腦血管、抑制自由

3、基的合成和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控等因素有關(guān)。那么吸入麻醉藥物是否可以增加Slit及其受體Robo信號(hào)機(jī)制的表達(dá)，從而發(fā)揮其腦保護(hù)作用呢？目前還沒有研究來證實(shí)這些問題。
　　 基于上述原因，本研究建立了模擬機(jī)體腦缺血再灌注損傷的原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪模型，選擇應(yīng)用于臨床多年的吸入麻醉藥異氟醚對(duì)氧糖剝奪的神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)。在此基礎(chǔ)上，觀察異氟醚后處理對(duì)氧糖剝奪的神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)后神經(jīng)元中Slit2、Robo1、Ro

4、bo4蛋白含量的變化和神經(jīng)元損傷凋亡情況的檢測，研究異氟醚后處理保護(hù)作用與Slit/Robo信號(hào)機(jī)制的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 CO2培養(yǎng)箱(thermo，美國);低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(thermo，美國);倒置顯微鏡(Olympus，日本);Ohmeda氣體監(jiān)測儀(Exeel210，美國);微量注射泵（浙江浙大醫(yī)學(xué)儀器有限公司，中國）;CCK8試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士

5、德生物工程有限公司，中國）;96孔和6孔無菌培養(yǎng)皿(Biofil，加拿大);高糖型(4.59/L) DMEM培養(yǎng)液、無糖型DMEM培養(yǎng)液(Hyelone，美國)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)，多聚賴氨酸(Sigma Aldrich，美國)，B27(Invitrogen，美國);Neurobasal無血清培養(yǎng)液(Invitrogen，美國)，0.125％胰蛋白酶(HyClone，美國);NSE抗體（武漢博士德生物工程有限公司）

6、;異氟醚（雅培公司，美國）;快速篩選型電泳系統(tǒng)(BIO-RAD，美國);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，RIPA buffer（碧云天生物技術(shù)研究所，中國）;高速離心機(jī)(thermo，美國);Slit2（多肽蛋白，R&D，美國）、Robo1-Fc(Robo1單克隆抗體)、Robo4-Fc(Robo4單克隆抗體)、anti-Slit2（多克隆抗體）、anti-Robo1（多克隆抗體）、anti-Robo4（多克隆抗體）、caspase-3

7、（多克隆抗體）(Santa Cruz，美國)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 將培養(yǎng)7d的皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)分為10組(n=10):正常培養(yǎng)組（C組）、OGD組(D組)、OGD+異氟醚組（I組）、OGD+Slit2組（S組）、OGD+R1組(R1組)、OGD+R4組(R4組)、OGD+異氟醚+R1組(IR1組)、OGD+異氟醚+R4組(IR4組)、OGD+Slit2+R1組(SR1組)、OGD+Slit2+R4組(SR4組)。C

8、組神經(jīng)元作為對(duì)照組，按正常培養(yǎng)方法培養(yǎng)。D組進(jìn)行氧糖剝奪模型處理6小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)。I組在進(jìn)行氧糖剝奪后復(fù)氧前接受2h異氟醚麻醉（氣體濃度2％）。S組、SR1組和SR4組均加入Slit多肽蛋白(濃度為1μg/L)。R1組、IR1組和SR1組加入Robo1-Fc(Robo1單克隆抗體，濃度為1nmol/L)，R4組、IR4組和SR4組加入Robo4-Fc(Robo4單克隆抗體，濃度為1nmol/L)。I組、R1組、R4組、IR1組、

9、IR4組、S組、SR1組、SR4組的氧糖剝奪處理同D組。IR1組、IR4組接受的異氟醚后處理同I組。在96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7d的神經(jīng)元隨機(jī)分到各組，進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測。6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7d的神經(jīng)元隨機(jī)分到各組，進(jìn)行神經(jīng)元純度鑒定、神經(jīng)元存活數(shù)目檢測、神經(jīng)元損傷檢測以及細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、Slit2、Robo1、Robo4的免疫印記檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過CCK8細(xì)胞活性檢測，S組(Slit2處理組)和I

10、組（異氟醚后處理組）的活性率明顯高于D組（氧糖剝奪組），但低于C組（對(duì)照組）(P＜0.05)。S組低于I組的活性率(P＜0.05)。IR1組（異氟醚后處理和Robo1-Fc處理組）的活性率低于I組(P＜0.05)，IR4組（異氟醚后處理和Robo4-Fc處理組）的活性率與I組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 SR1組(Slit2處理和Robo1-Fc處理組)的活性率低于S組(P＜0.05)，SR4組(Slit2處理和Robo4-Fc處

11、理組)的活性率與S組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 通過LDH細(xì)胞損傷檢測，S組和I組的損傷程度明顯低于D組，但高于C組(P＜0.05)。S組高于I組的損傷程度(P＜0.05)。IR1組的損傷程度高于I組(P＜0.05)，IR4組的損傷程度與I組比較無顯著性差異(P＞0.05)。SR1組的損傷程度高于S組(P＜0.05)，SR4組的損傷程度與S組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 通過western-bl

12、otting免疫蛋白印記技術(shù)，檢測了C組、D組、S組和I組神經(jīng)元中凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)。其中，進(jìn)行氧糖剝奪的D組神經(jīng)元中，凋亡蛋白caspase-3的活性片段19kDa的表達(dá)顯著高于對(duì)照組C組、給予Slit多肽蛋白的S組和給予異氟醚后處理的I組(P＜0.05)。而S組、I組在凋亡蛋白caspase-3的活性片段19kDa的表達(dá)，高于C組(P＜0.05)。S組與I組比較， I組低于S組(P＜0.05)。
　　 通過we

13、stern-blotting免疫蛋白印記技術(shù)，檢測了C組、D組和I組中神經(jīng)元Slit2、Robo1、Robo4蛋白表達(dá)的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)異氟醚干預(yù)的神經(jīng)元即I組中，Slit2、Robo1表達(dá)含量均比D組中表達(dá)含量增加(P＜0.05)，但是Robo4的表達(dá)含量變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、 Slit2通過激動(dòng)Robo1受體能夠減少氧糖剝奪模型中原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷及凋亡。