嗅鞘細胞分泌表達NGF，BDNF對糖氧剝奪神經(jīng)元的保護與其調(diào)控Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與再生修復(fù)是當今神經(jīng)科學研究領(lǐng)域的熱點和難點，其中有關(guān)神經(jīng)及其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子一直是人們關(guān)注的焦點。通過移植胚胎干細胞或外周神經(jīng)，嗅鞘細胞(OECs)等及其分泌的營養(yǎng)因子來改善神經(jīng)損傷的微環(huán)境，易化受損傷中樞神經(jīng)再生的潛能，從而達到修復(fù)治療的目的。OECs是近年備受學者關(guān)注的可明顯促進神經(jīng)再生的細胞之一，其生物學特性廣泛，可表達多種促神經(jīng)存活和細胞黏附的物質(zhì)如神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)

2、，從而發(fā)揮其生物學功能。人們通過OECs移植的體內(nèi)、體外實驗證實，OECs能介導(dǎo)受損的神經(jīng)元的軸突再生出芽，并形成相應(yīng)的突觸聯(lián)系，從而修復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)的功。但是，OECs對缺血缺氧的中樞神經(jīng)元凋亡的保護作用鮮有報導(dǎo)，OECs及其分泌的細胞因子對大腦皮層神經(jīng)元缺血缺氧后的作用如何？是否能起到內(nèi)源性的保護作用及抗凋亡作用?目前該方面研究得還不很深入。NGF，BDNF是否對大腦皮層神經(jīng)元缺血缺氧損傷有再生修復(fù)作用？它們是否通過Ras-MAP

3、K信號傳導(dǎo)通路起作用？這些均值得我們進一步研究。本研究的目的是通過體外實驗觀察OECs，NGF和BDNF對缺血缺氧的皮層神經(jīng)元的軸突保護及抗凋亡作用，進一步探討其啟動的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護機制。
　　 方法：①從出生24hr的SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠的嗅球(Olfactory Bulb，OB)取材進行OECs原代培養(yǎng)。利用差速貼壁方法純化，清除大部分神經(jīng)元及其它混雜細胞。低親和力神經(jīng)生長因子

4、受體(low affinity growth factor receptor,p75NGR)抗體免疫染色鑒定OECs，待其融合度達70％左右時，制備條件培養(yǎng)基。②從出生24hr內(nèi)的SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠的大腦半球取材進行皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。通過降低血清濃度和加入阿糖胞苷(Ara-C)純化，清除大部分膠質(zhì)細胞及其它混雜細胞。MAP-2免疫染色鑒定皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)至第7～8d，制備缺血缺氧模型。③取培養(yǎng)板中生長良好

5、，8d左右的神經(jīng)元進行OGD培養(yǎng)：吸盡培養(yǎng)液，加入無糖成分的缺氧液(PH=7.35)漂洗，放入密閉容器中，通入5％CO2和95％N2，密閉培養(yǎng)1.5hr后，換為復(fù)氧液，繼續(xù)培養(yǎng)4hr。④體外純化培養(yǎng)OECs，利用MTT檢測細胞活性，免疫組化，RT-PCR，WesternBlotting檢測其NGF,BDNF等各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌表達。⑤OECs純化培養(yǎng)后，待其融合達70％左右時，去除原培養(yǎng)基，加入無血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24hr收集培養(yǎng)上

6、清，10000 rpm離心15min，取上清，即為OECs條件培養(yǎng)基，添加到生長良好的8d左右的神經(jīng)元中繼續(xù)培養(yǎng)。⑥按照差速貼壁法對OECs進行原代培養(yǎng)純化，純化好的OECs待其融合達70％左右時，加入胰酶消化重懸后加到生長良好的8d左右的神經(jīng)元培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。⑦利用MTT，細胞免疫熒光等檢測細胞活性及軸突長度，TUNEL染色檢測凋亡水平，RT-PCR及Western Blotting檢測缺氧前后對OECs及神經(jīng)元GAP-43，NGF

7、，BDNF及NGFIA的表達。⑧取培養(yǎng)板中生長良好，培養(yǎng)8d左右的神經(jīng)元按下述隨機分組：1)對照組：單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)；2)NGF(50ng/ml)組：在缺氧前30min加入NGF50ng/ml：3)NGF+NGF抗體組：缺氧前1hr加入10umol/L的NGF抗體，30min后加入NGF50ng/ml；4)BDNF(50ng/ml)組：在缺氧前30min加入BDNF50ng/ml：5)BDNF+BDNF抗體組：缺氧前1 hr加入10umol

8、/L的BDNF抗體，30min后加入BDNF50ng/ml；6)NGF+BDNF(50ng/ml)組：在缺氧前30min加入NGF50ng/ml及BDNF50ng/ml，上述各組放入5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24hr后分別經(jīng)OGD1.5hr，復(fù)糖復(fù)氧4hr處理。⑨利用Western Blotting檢測NGF，BDNF對信號調(diào)節(jié)通路Ras-MAPK各階段激酶表達影響。
　　 結(jié)果：⑴采用差速貼壁法進行OECs純化培養(yǎng)

9、，純度可達90％。⑵OECs生長成一定規(guī)律，在培養(yǎng)約9d時達高峰，RT-PCR和Western Blotting顯示其表達NGF，BDNF，NT-3，NT-4等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。⑶OGD處理后，上清組及共培養(yǎng)組存活細胞活性和軸突總長度明顯優(yōu)于對照組(p＜0.01)，而上清組與共培養(yǎng)組比較，后者的保護作用更明顯(p＜0.05)。⑷MTT法檢測細胞存活率可見對照組神經(jīng)元的存活率較缺氧前明顯下降(48.82±1.76％)(p＜0.01)，經(jīng)過

10、OECs條件培養(yǎng)基預(yù)處理之后，神經(jīng)元的存活率較對照組分別有所升高(上清組：69.55±2.78％，共培養(yǎng)組：78.13±3.09％)(p＜0.01)。⑸TUNEL顯示對照組缺氧后神經(jīng)元的凋亡率明顯升高(51.5±5.68％)(p＜0.05)，經(jīng)過OECs條件培養(yǎng)基預(yù)處理之后，神經(jīng)元的凋亡率較對照組都有明顯減低(上清組：33.12±5.04％，共培養(yǎng)組：25.83±8.64％)(p＜0.05)。⑹RT-PCR結(jié)果顯示OECs能使經(jīng)過缺氧處

11、理的細胞GAP-43的mRNA表達上調(diào)；缺氧處理能使細胞本身NGF，BDNF表達減弱，復(fù)氧后也無變化甚至更弱(模擬缺血缺氧再灌注損傷且無OECs保護)，但OECs能使營養(yǎng)因子表達重新增強，并且刺激NGFIA的表達，說明缺氧刺激OECs分泌表達NGF，BDNF。⑺Western Blotting結(jié)果顯示OECs能使經(jīng)過缺氧處理的細胞GAP-43的表達上調(diào)(p＜0.001)。其中OECs共培養(yǎng)組較OECs上清組保護作用強(p＜0.05)。⑻

12、添加NGF，BDNF后OGD處理，其存活細胞的活性，軸突總長度，平均樹突長度明顯優(yōu)于單純?nèi)毖踅M(p＜0.01)，其中NGF保護效果比BDNF好，而同時添加兩種因子保護效果并沒有累加，添加相應(yīng)的抑制劑后作用被阻滯。⑼MTT法檢測細胞活性可見對照組神經(jīng)元活性較缺氧前明顯下降(0.1964±0.0005)(p＜0.001)，經(jīng)過NGF，BDNF及兩者共預(yù)處現(xiàn)缺氧復(fù)氧后，神經(jīng)元的活性較對照組分別有所升高(NGF組：0.4251±0.0047，B

13、DNF組：0.3309±0.0043，NGF+BDNF組：0.2693±0.0024)(p＜0.001)，NGF保護作用最強，BDNF與兩者共添加效果相當。⑽TUNEL顯示對照組缺氧后神經(jīng)元的凋亡率明顯升高(51.5±5.68％)(p＜0.05)，經(jīng)過NGF，BDNF及兩者共預(yù)處理之后，神經(jīng)元的凋亡率較對照組都有明顯減低，(p＜0.05)(NGF組：27.9±3.54％，BDNF組：32.4+2.27％，NGF+BDNF組：30.8±3

14、.11％)。其中又以NGF凋亡率最低(與另外兩處理組比較p＜0.05)。⑾Western Blotting結(jié)果顯示添加NGF，BDNF，NGF+BDNF也出現(xiàn)GAP-43表達上調(diào)(p＜0.001)。NGF保護作用最強(p＜0.05)。BDNF與NGF+BDNF效果則相當(p＞0.05)。⑿缺氧本身就可以使ERK1/2表達增加。NGF，BDNF能使神經(jīng)元急性缺氧胞內(nèi)Ras-MAPK通路中的ERK1/2，CREB的磷酸化表達增加(p＜0.0

15、1)，其中缺氧1～2hr內(nèi)尤為明顯。且能被通路上相對應(yīng)的抑制劑PD98095和UO126所阻斷，同樣地阻斷高峰在缺氧處理后1～2hr。但不影響胞內(nèi)總ERK1/2，總CREB的表達。其中NGF的表達還和早期快反應(yīng)蛋白NGFIA的上調(diào)有關(guān)。
　　 結(jié)論：①OECs可以通過差速貼壁與阿糖胞苷綜合方法原代培養(yǎng)獲得，利用不同檢測方法發(fā)現(xiàn)OECs分泌表達NGF，BDNF和NT-3等。②OECs能有效地使缺氧損傷神經(jīng)元修復(fù)，具有抗神經(jīng)元凋亡作

16、用。其抗凋亡作用可能是通過分泌表達多種營養(yǎng)因子誘導(dǎo)軸突延伸和修復(fù)，GAP-43與神經(jīng)再生有較好的平行相關(guān)性。表明OECs具有促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的巨大潛能。③OGD是能較好地模擬體內(nèi)急性缺血缺氧的病理模型。利于研究腦梗死的保護因素和功能修復(fù)。④NGF，BDNF具有抑制損傷神經(jīng)元凋亡，誘導(dǎo)神經(jīng)突起形成，促進神經(jīng)細胞存活和功能恢復(fù)的保護作用。其作用是通過使Ras-MAPK通路中的ERK1/2，CREB的磷酸化表達增加來實現(xiàn)的。提示Ra