組胺H3受體激動劑減輕異氟醚引起的發(fā)育期大鼠神經(jīng)元凋亡及記憶損害.pdf

1、目的：
　　嬰幼兒的臨床醫(yī)療中常需要使用全身麻醉藥物，其安全性及對腦的發(fā)育和長期認知功能是否有不良影響，一直是專家學者以及患兒父母關注的問題。目前全麻藥如何導致認知功能的損害或缺失目前仍未闡明清楚，并且缺乏其有效的臨床干預手段。研究全麻藥發(fā)育期神經(jīng)毒性的發(fā)生機制，探尋有效的干預途徑是目前研究的熱點和重點之一，并具有重要的理論與實踐意義。本課題擬利用異氟醚引起的發(fā)育期神經(jīng)毒性模型，觀察組胺H3受體激動劑RAMH對全麻藥異氟醚發(fā)育期神

2、經(jīng)毒性的作用。以期明確:(1)RAMH預處理對異氟醚引起的新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響。(2)RAMH預處理對異氟醚引起的幼年大鼠記憶損害的影響。(3)異氟醚暴露后發(fā)育期大鼠海馬p53表達及RAMH的影響。
　　方法：
　　1.RAMH預處理對異氟醚引起的新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響
　　用出生第6天新生SD大鼠，隨機均分為3組。對照組4只，給予腹腔注射5％葡萄糖;模型組5只，正常造模，吸入1.6％的異氟醚持續(xù)6小

3、時，復蘇2小時;RAMH預處理組5只，先腹腔注射RAMH(0.1mg/10g)后30分鐘，然后造模，吸入1.6％的異氟醚6小時。造模時，吸入氧濃度為21％，輸出氣體總流量為1.5L/分鐘，異氟醚濃度1.6％。每小時連續(xù)監(jiān)測新生大鼠呼吸及皮膚色澤情況，等6小時異氟醚吸入麻醉完畢后，關閉異氟醚，繼續(xù)吸入21％氧氣，給予蘇醒期2小時，待新生大鼠自然蘇醒。造模完成后，灌注取腦，將腦組織放入4攝氏度多聚甲醛溶液浸泡，后固定24小時。然后按15％到

4、30％的蔗糖濃度的梯度脫水，直至大腦組織沉底。接著以冠狀位，包埋腦組織。放入-80攝氏度快速冷卻。以冠狀位行冰凍切片，切片厚度20um。而后進行免疫熒光染色，觀察Caspase-3在各腦區(qū)的表達情況。
　　2.RAMH預處理對異氟醚引起的幼年大鼠記憶損害的影響。
　　用出生第6天新生SD大鼠，隨機均分為4組。CON組7只，給予腹腔注射5％葡萄糖;ISO組7只，正常造模，吸入1.6％的異氟醚持續(xù)7小時，然后復蘇2小時;RAMH

5、組7只，腹腔注射RAMH(10mg/kg)后，放回鼠籠;RAMH+ISO組7只，先腹腔注射RAMH（10mg/kg）后30分鐘，造模，吸入1.6％的異氟醚6小時。造模完成后，將新生SD大鼠統(tǒng)一放回鼠籠，直至第5周，進行Morris水迷宮實驗。用分析軟件分析大鼠的游泳路線、尋找平臺潛伏期和新生大鼠在目標象限停留時間以及其距目標平臺的平均距離，從而測試大鼠的空間學習和記憶能力。
　　3.異氟醚暴露后發(fā)育期大鼠海馬p53表達及RAMH的

6、影響。
　　用出生第6天新生SD大鼠，隨機均分為3組。對照組5只，給予腹腔注射5％葡萄糖;模型組5只，正常造模，吸入1.6％的異氟醚持續(xù)6小時，復蘇2小時;RAMH預處理組5只，先腹腔注射RAMH(10mg/kg)后30分鐘，然后造模，吸入1.6％的異氟醚6小時。造模時，吸入氧濃度為21％，輸出氣體總流量為1.5L/分鐘，異氟醚濃度1.6％。每小時連續(xù)監(jiān)測新生大鼠呼吸及皮膚色澤情況，等6小時異氟醚吸入麻醉完畢后，關閉異氟醚，繼續(xù)吸

7、入21％氧氣，給予蘇醒期2小時，待新生大鼠自然蘇醒。造模完成后，迅速將新生大鼠斷頭，取出大腦，分離出雙側海馬，用液氮快速冷凍后，置于-80攝氏度冰箱保存。然后提取目的蛋白，用BCA法測定樣品的蛋白濃度，并使蛋白變性。然后制作Page凝膠，組裝電泳槽進行蛋白電泳，使樣品目的蛋白分開。然后通過轉(zhuǎn)膜的方法把蛋白從Page凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后封閉，孵育一抗，二抗，最后顯影。觀察在RAMH預處理后異氟醚暴露下發(fā)育期大鼠海馬p53的表達情況

8、。
　　結果：
　　1.新生第6天的SD大鼠，在異氟醚暴露6小時后，海馬各區(qū)（包括CA1、CA3、DG區(qū)）Caspase-3信號表達顯著增強，神經(jīng)元凋亡明顯，而給予組胺H3受體激動劑RAMH的新生大鼠相較于模型組海馬各區(qū)Caspase3信號表達減少，神經(jīng)元凋亡得以改善。
　　2.新生第6天的SD大鼠，在異氟醚暴露6小時后，飼養(yǎng)至出生第5周，ISO組幼年大鼠在第1、2、3、4天尋找平臺潛伏期明顯延長，且在目標象限停留時間

9、明顯減少，而距目標平臺的平均距離明顯增加。而RAMH+ISO組與ISO組相比，在第1、2天尋找平臺潛伏期沒有明顯改變，而第3、4、5天尋找平臺潛伏期明顯減少，且在目標象限停留時間明顯增長，而距目標平臺的平均距離明顯縮短。
　　3.新生第6天的SD大鼠，在異氟醚暴露6小時后，ISO組新生大鼠海馬區(qū)p53蛋白表達明顯增多。而RAMH+ISO組與ISO組相比，發(fā)育期大鼠海馬區(qū)p53蛋白表達明顯減少。
　　結論：
　　RAMH