家兔組胺H3受體基因克隆及可變剪接鑒定.pdf

1、RNA的選擇性剪接(可變剪接)機(jī)制的存在使單個(gè)基因具有產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)的能力，是增加真核基因表達(dá)多樣性的一個(gè)非常廣泛的機(jī)制。愈來愈多的人類疾病被發(fā)現(xiàn)與不正常的選擇性剪接相關(guān)，據(jù)估計(jì)，至少15﹪～50﹪的人類遺傳性疾病是由于基本剪接信號或輔助調(diào)控元件發(fā)生突變而造成。H3受體mRNA可以發(fā)生選擇性剪接，自從1999年Lovenberg等人將人類的H3受體cDNA克隆以來，豚鼠、大鼠、小鼠、猴子和倉鼠的H3受體cDNA也相繼被克隆和測序，并在人

2、類、豚鼠、大鼠、小鼠和倉鼠中發(fā)現(xiàn)H3受體的選擇性剪接，但在猴子中未發(fā)現(xiàn)，兔子還未見報(bào)道。組胺H3受體被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)組胺、乙酰膽堿、谷氨酸、多巴胺，5-羥色胺(血清緊張素)和去甲腎上腺素等多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，與覺醒、活動能力、體溫調(diào)節(jié)、攝食、學(xué)習(xí)與記憶等生理功能有關(guān)，人們正在研究以H3受體作為靶點(diǎn)來治療睡眠障礙、肥胖、哮喘、心臟疾病、偏頭痛、癲癇和一些認(rèn)知缺陷性疾患，如注意力缺陷/多動紊亂、早老性癡呆和精神分裂癥等。因此H3受體具有

3、作為靶標(biāo)開發(fā)高效和選擇性的新型拮抗類和激動類藥物的巨大潛力。家兔作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動物，有可能被用作H3受體相關(guān)疾病的動物模型的建立，對家兔H3受體基因進(jìn)行克隆并研究其可變剪接可能具有積極意義。 本研究的主要目的是克隆家兔H3受體基因的編碼區(qū)并對其可變剪接進(jìn)行檢測和鑒定。為了克隆家兔H3受體基因，我們采用了分段克隆不同外顯子的策略，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，分別用從家兔的肝臟中提取的

4、DNA和從家兔的大腦皮層提取的總RNA作為模板，使用根據(jù)已知動物的H3受體基因設(shè)計(jì)的保守引物，擴(kuò)增出了家兔H3受體基因編碼區(qū)的三個(gè)片段，將PCR和RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，然后連接到T載體，克隆到菌株E.coliDH5α，測序得到目的片段的堿基序列。最后將三個(gè)片段通過重疊序列拼接成完整的家兔H3受體基因編碼序列。然后根據(jù)獲得的家兔H3受體cDNA序列，在編碼家兔H3受體第3細(xì)胞內(nèi)環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過對可變剪接產(chǎn)物

5、進(jìn)行RT-PCR，然后將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，再連接到T載體，克隆到菌株E.coliDH5α，測序得到目的片段的堿基序列。最后通過與家兔H3受體cDNA編碼區(qū)全長的序列比對，推測出發(fā)生可變剪接的位點(diǎn)和剪去片段的長度。 本研究獲得的結(jié)果表明，家兔H3受體基因編碼區(qū)全長1338bp,推測編碼445個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，與已知動物的H3受體推測的長度一致。在家兔大腦皮質(zhì)中檢測到至少三種可變剪接產(chǎn)物，經(jīng)