創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因及線粒體通路機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是由于異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致出現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)性精神障礙,其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡(jiǎn)而言之,PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[1,2]。近年來,隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外的不斷增多,PTSD已經(jīng)成為一種普遍的精神障礙而被關(guān)注[3]。目前,PTSD及其神經(jīng)生物學(xué)致病

2、機(jī)制的探討已成為涉及創(chuàng)傷學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)、心理學(xué)等跨學(xué)科研究的重點(diǎn)。
　　 下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸系統(tǒng)在應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),PTSD不同于一般的應(yīng)激反應(yīng)及其它精神疾病,PTSD患者血液中的皮質(zhì)酮基礎(chǔ)水平往往較低,存在HPA軸的紊亂[4]。糖皮質(zhì)激素(GC)是腎上腺皮質(zhì)分泌的重要應(yīng)激激素。GC受體有糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidr

3、eceptor,GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū),也是腦部GR含量最高的區(qū)域,因此在應(yīng)激過程中海馬是糖皮質(zhì)激素攻擊的主要靶區(qū)[5]。近年來,對(duì)遭受戰(zhàn)爭(zhēng)和暴力之后的PTSD患者進(jìn)行磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)檢查,發(fā)現(xiàn)有海馬萎縮的現(xiàn)象[6]。PTSD患者海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)生了明顯的變化,主要表現(xiàn)為體積變小[

4、7],但其發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。
　　 細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程,是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、生理及病理性死亡的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡的調(diào)控,主要有三條誘導(dǎo)途徑:外源性途徑,即死亡受體途徑；內(nèi)源性途徑,即線粒體途徑；此外還有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[8,9]。不同的死亡信號(hào)通過不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。長(zhǎng)期以來,線粒體一直被公認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的能量加工廠,其主要作用是為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供所需的能量。但越來越多的研究表明,在細(xì)胞凋亡過程中

5、,許多重要事件的發(fā)生都與線粒體密切相關(guān),如線粒體膜電位的喪失、細(xì)胞色素C(Cytochrome C,CytC)的釋放、Bcl-2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與等等[10]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)死亡信號(hào)的重要感受器與放大器。在細(xì)胞凋亡早期,核染色體DNA還未改變之前,已出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化,說明線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起重要作用[11]。凋亡信號(hào)經(jīng)線粒體放大,線粒體再釋放CytC、Smac/DIABLO和絲氨酸蛋白Omi/HtrA2,激活

6、Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終引起凋亡,這是Caspase依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路。線粒體也可釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis induce factor,AIF)、核酸內(nèi)切酶G直接引起凋亡,這是Caspase非依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[12]。
　　 線粒體在細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用越來越受到人們的關(guān)注。于是,有人提出GC受體可以與線粒體作用而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的假說[13]:第一,非基因組的作用。應(yīng)激活化的大量GR可以直接與線粒體膜結(jié)合而改變線

7、粒體膜電位。第二,基因組的作用。GC可以與其他的一些分子如熱休克蛋白等相互作用,從而易位入細(xì)胞核,與DNA結(jié)合并影響轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。Bax作為GR活化的下游調(diào)制器之一,可以被上調(diào)并易位入線粒體與凋亡調(diào)制器MAP-1結(jié)合。這兩種方式均可以導(dǎo)致線粒體膜電位改變。線粒體膜電位下降,即可引起線粒體膜間隙的CytC釋放至胞質(zhì)。釋放入胞質(zhì)的CytC在ATP或dATP的輔助下可特異地與凋亡蛋白酶激活因子(Apoptoticprotease activati

8、ng factors,Apaf-1)結(jié)合成復(fù)合體,啟動(dòng)Caspase-9形成全酶,導(dǎo)致Caspase-9活化。后者繼續(xù)激活其下游分子,包括Caspase-3等,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。
　　 在我國(guó),由于地震、洪水等自然災(zāi)害時(shí)有發(fā)生,災(zāi)后一些人會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期焦慮與激動(dòng)情緒。同時(shí)隨著社會(huì)的發(fā)展、生活的節(jié)奏加快,來自社會(huì)、家庭、工作的壓力不斷增大,這些均成為PTSD誘發(fā)因素。因而如何治療這些因?yàn)?zāi)難、壓力而引起的精神疾病是一個(gè)刻不容緩的

9、課題。以往由于缺乏理想的動(dòng)物模型,使PTSD的基礎(chǔ)研究受到了很大限制。SPS模型作為PTSD動(dòng)物模型的確認(rèn),為深入研究應(yīng)激障礙的發(fā)病機(jī)理提供了行之有效的方法。目前,關(guān)于PTSD細(xì)胞凋亡的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此,本課題引用國(guó)際上最新的SPS做為PTSD動(dòng)物模型來進(jìn)行PTSD的基礎(chǔ)研究,首次揭示PTSD海馬細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)基因及線粒體通路的調(diào)控機(jī)制,從而為這一疾病的預(yù)防、診斷和治療尋找一條有效的途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　

10、　 采用國(guó)際認(rèn)定的無連續(xù)單一應(yīng)激(Single-Prolonged Stress,SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型。應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL染色法)檢測(cè)PTSD大鼠海馬細(xì)胞凋亡的規(guī)律；應(yīng)用透射電子顯微鏡術(shù)觀察PTSD大鼠海馬凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用體視學(xué)方法測(cè)定PTSD大鼠海馬體積的變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9

11、和Caspase-3蛋白含量的變化；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA含量的變化；應(yīng)用免疫雙標(biāo)、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)觀察PTSD大鼠海馬Bcl-2和Bax以及Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)與共存；應(yīng)用酶電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察PTSD大鼠海馬線粒體細(xì)胞色素C的表達(dá)與釋放。
　　 結(jié)論
　　 1、PTSD大鼠出現(xiàn)了海馬萎縮現(xiàn)象,神經(jīng)元凋亡可能是導(dǎo)致PTSD大鼠海馬發(fā)生萎縮的因?yàn)橹?/p>

12、一。
　　 2、凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax含量增加以及兩者比值的失衡可能是導(dǎo)致PTSD大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡的重要機(jī)制。
　　 3、在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元中,線粒體腫脹、外膜破裂,大量CytC釋放入胞質(zhì)。
　　 4、CytC從線粒體釋放入胞質(zhì)是引發(fā)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵步驟。
　　 5、Caspase-9和Caspase-3在PTSD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的調(diào)控中均發(fā)揮了重要作用,線粒體通路的