鹽誘導激酶1在高糖誘導的HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用及二甲雙胍的干預.pdf

1、目的：
　　肝臟是通過調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝來維持系統(tǒng)能量平衡的重要臟器。肝臟的脂質(zhì)合成與葡萄糖代謝是密切相關(guān)的，當肝臟中的葡萄糖水平超過肝臟糖原的儲存能力時，葡萄糖通過糖酵解、氧化等途徑就轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸，作為甘油三酯（Triglycerides，TG）合成的底物，使TG過多地聚集在肝臟的細胞內(nèi)，導致脂肪性肝的形成。在高濃度葡萄糖（高糖）培養(yǎng)HepG2細胞誘導的實驗性肝細胞脂肪變性和高糖喂養(yǎng)誘導的動物非酒精性脂肪肝?。∟on-al

2、coholic fatty liver disease，NAFLD）模型中，均可發(fā)現(xiàn)生脂基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（ Sterol regulatory element-binding Protein-1c，SREBP-1c），脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase， FASN）和乙酰輔酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylaseα，ACC1）的表達增加,TG的含量增多。二甲雙胍作為一磷酸腺苷活化性蛋白激

3、酶（ AMP-activated protein kinase，AMPK）的激動劑，能恢復高糖抑制的AMPK蘇氨酸172位點（AMPK pThr172，是AMPK的磷酸化位點）的活性，減少高濃度葡萄糖引起的HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)合成。鹽誘導激酶1（Salt induced kinase1，SIK1）屬于AMPK家族，參與調(diào)節(jié)哺乳動物的脂代謝，能直接調(diào)節(jié)SREBP-1c的表達和活性。在2型糖尿病并發(fā)的非酒精性脂肪肝病的大鼠肝臟中，SIK1

4、的表達降低，SREBP-1c的表達增加，TG含量增加。過表達SIK1能降低SREBP-1c及其下游生脂基因FASN和ACC1的水平。我們近期報道了在高濃度葡萄糖孵育的大鼠腎系膜的細胞系HBZY-1細胞中，SIK1的mRNA和蛋白水平是降低的，同樣SIK1的活性也是降低的（通過檢測SIK1磷酸化位點絲氨酸182位點的蛋白水平，SIK1 pThr182,與其對應的是AMPK pThr172），導致系膜細胞的增殖。然而，SIK1在高糖誘導的H

5、epG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用，以及二甲雙胍是否可以通過調(diào)節(jié)SIK1來調(diào)控高糖誘導的HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積并不清楚。
　　因此，我們采用高糖誘導HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積模型，首次探討SIK1在高糖誘導的HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用，并通過在HepG2細胞中高表達SIK1和二甲雙胍的干預，進一步研究二甲雙胍是否可以通過調(diào)節(jié) SIK1來調(diào)控高糖誘導的 HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。
　　方法：
　　1.人類肝癌細胞

6、系 HepG2細胞培養(yǎng)在含有正常糖（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、10％胎牛血清（Foetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（100ug/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）的DMEM培養(yǎng)基中。放進濕潤環(huán)境的培養(yǎng)箱（二氧化碳濃度為5%，溫度設置是37℃）中進行培養(yǎng)。當HepG2細胞生長融合到大約80%時，在無血清的正常糖（葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L）培養(yǎng)液中無血清化24h。然后，HepG2細胞在高濃度葡萄糖（葡

7、萄糖的濃度為25 mmol/L，高糖）中培養(yǎng)24h誘導HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的模型。HepG2細胞中的脂滴情況通過油紅O染色進行觀察，細胞中TG的含量使用TG試劑盒檢測，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和Western Blot分別檢測SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達， Western Blot檢測

8、SIK1 pThr182的蛋白表達水平（即SIK1的活性），細胞經(jīng)免疫熒光技術(shù)后，激光共聚焦顯微鏡（Confocal microscopy）下觀察SIK1在細胞內(nèi)的分布。
　　2.為了確定SIK1與高糖誘導的脂質(zhì)合成的直接關(guān)系，構(gòu)建重組質(zhì)粒GV230-SIK1，轉(zhuǎn)染到HepG2細胞，正常糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR和Western Blot檢測SIK1的轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染48h后的HepG2細胞，高濃度葡萄糖進一步處理24h，細胞

9、中的脂滴情況通過油紅O的染色進行觀察，TG在細胞中的含量通過使用TG試劑盒檢測，RT-PCR和Western Blot分別檢測SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達， Western Blot檢測SIK1 pThr182的蛋白水平（即SIK1的活性），SIK1在細胞內(nèi)的分布在Confocal microscopy下進行觀察。
　　3.研究表明二甲雙胍能抑制高糖誘導的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)合成，為了研究二甲雙

10、胍是否可以通過調(diào)節(jié)SIK1來抑制高糖誘導的HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，我們將HepG2細胞放在含正常糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，融合至大約80%，用正常糖培養(yǎng)基（不含血清的）進行無血清化培養(yǎng)24h，二甲雙胍預處理1h，再用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。MTT法觀察二甲雙胍對 HepG2細胞存活的影響，觀察細胞內(nèi)的脂滴形成情況和甘油三脂的含量，檢測SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達，以及SIK1 pThr182的蛋白水

11、平（即SIK1的活性），SIK1在細胞內(nèi)的分布在Confocal microscopy下進行觀察。
　　結(jié)果：
　　1.高糖（葡萄糖濃度為25 mmol/L）培養(yǎng)HepG2細胞24h后，細胞內(nèi)的脂質(zhì)合成明顯增加，TG的含量明顯增多；生脂基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達增加；
　　2.高濃度葡萄糖（25 mmol/L D-葡萄糖）培養(yǎng)HepG2細胞24h后，SIK1的表達和活性降低，SIK1從細胞質(zhì)向細胞核

12、轉(zhuǎn)移（SIK1入核）。
　　3.在HepG2細胞中過表達SIK1，會抑制高糖誘導的HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和生脂基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達。
　　4.二甲雙胍處理后，會抑制高濃度葡萄糖誘導的HepG2細胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和脂質(zhì)合成基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達。
　　5.二甲雙胍能活化SIK1，上調(diào)SIK1的mRNA和蛋白表達水平，SIK1部分從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移（SIK1出核）。