二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞增殖的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)作為慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease，COPD)的重要并發(fā)癥之一，直接影響了COPD患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。然而目前對于COPD相關(guān)PH尚無療效可靠的預(yù)防和治療措施。傳統(tǒng)觀念認為COPD肺血管床毀損、由低氧導(dǎo)致的肺血管收縮和血管重構(gòu)是引起PH形成的主要機制，然而在治療上基于此理論而給予的治療手段包括氧療

2、、血管擴張劑及現(xiàn)有的用于治療PH的藥物和治療手段并不能逆轉(zhuǎn)COPD相關(guān)PH的持續(xù)進展。因此我們必須重新審視COPD相關(guān)PH的發(fā)病機制，探索肺血管重塑的潛在致病因素，以期尋找早期有效的防治方法。
　　80-90％COPD患者與吸煙有關(guān)，研究證實吸煙致COPD患者的早期無低氧階段，甚至在肺功能正常階段，就已經(jīng)出現(xiàn)了肺血管重構(gòu)的現(xiàn)象;長期吸煙的PH患者中，其血循環(huán)中炎癥因子包括白介素（IL-6）、腫瘤壞死因子(TNF-a)、單核細胞趨化

3、蛋白-1(MCP-1)等，和平均動脈壓有較強的直線相關(guān)性，高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平可作為肺動脈高壓的獨立預(yù)測因子。這些證據(jù)充分闡明了，在慢性阻塞性肺病患者合并PH的肺血管重構(gòu)過程中，吸煙所引起的肺血管的慢性炎癥扮演了重要的角色。肺血管重構(gòu)是PH的基本病理特征，其中肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smoothmuscle cell，PASMCs)表型轉(zhuǎn)化-從收縮型（分化）向合成型（未分化）轉(zhuǎn)化（分化標志物

4、SMA， SM22α等下調(diào)或消失是PASMCs表型轉(zhuǎn)化的標志），是獲得異常增殖/遷移、合成分泌能力致肺血管重構(gòu)和肺動脈高玉形成的前提和基礎(chǔ)，盡管目前已公認香煙致慢性炎癥在肺血管重構(gòu)中的關(guān)鍵地位，但涉及其中的確切機制并未闡明，尤其是香煙暴露下調(diào)控PASMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號機制尚不清楚。
　　調(diào)控細胞能量代謝平衡-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)正作為調(diào)控機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

5、的重要靶點備受關(guān)注。眾多的研究證據(jù)顯示，機體氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)程度的變化與AMPK活性改變有密切的關(guān)系，AMPK活性上調(diào)可明顯抑制炎癥反應(yīng)和基體高氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而起到保護基體組織的作用。臨床上廣泛使用的降糖藥物二甲雙胍(metformin)是AMPK激活劑，2009年Agard等的研究顯示二甲雙胍抑制野百合堿和低氧誘導(dǎo)的PH形成，此項研究雖然未直接探討其機制，但推測其機制可能與AMPK激活有關(guān)。Isoda等對內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及

6、巨噬細胞的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過AMPK抑制NF-κB激活從而降低IL-1β誘導(dǎo)的IL-6等炎癥促進因子的表達水平;提示二甲雙胍可能通過活化AMPK，引起AMPK磷酸化發(fā)揮抗炎作用。
　　基于上述研究結(jié)果，我們推測AMPK失活可能是吸煙COPD患者肺血管重構(gòu)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，二甲雙胍上調(diào)AMPK活性有望抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，阻止肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓形成。本研究擬通過原代培養(yǎng)SD(Sprague Dawley)大鼠肺動脈平滑肌細

7、胞，觀察二甲雙胍對尼古丁(nicotine)誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響，并探討其可能機制，最終為吸煙所致COPD相關(guān)相關(guān)的防治提高新策略。
　　目的：
　　1、明確不同濃度尼古丁對PASMCs增殖的影響
　　2、明確二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響;
　　3、明確二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)PASMCs釋放IL-6、TNF-α及ROS生成的影響;
　　4、探討二甲雙胍對尼古丁暴露下PASMCs中AMPK

8、表達和活性的影響。
　　方法：
　　實驗材料:
　　雄性SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學動物中心。
　　實驗方法:
　　1、PASMCs的原代培養(yǎng)及鑒定;
　　2、CCK-8法檢測不同濃度的尼古丁對PASMCs增殖的影響;
　　3、CCK-8法檢測二甲雙胍對尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響;
　　4、ELISA檢測試劑盒檢測尼古丁干預(yù)PASMCs后IL-6和TNF-α釋放及二甲雙胍干預(yù)后IL-6和

9、TNF-α釋放水平變化;
　　5、流式細胞技術(shù)檢測細胞活性氧(ROS)水平
　　6、Western blot檢測PASMCs中AMPK蛋白的表達和活性變化;
　　結(jié)果：
　　1、光鏡下可見，第3代細胞呈長梭形，典型的“峰-谷”樣生長。免疫熒光染色可見細胞質(zhì)內(nèi)α-actin蛋白FITC標記的熒光二抗染成綠色，呈與細胞長軸平行的絲狀分布，經(jīng)DAPI染色的胞核為藍色;
　　2、0.1μmol/L尼古丁促PASMC

10、s增殖效應(yīng)最強(P＜0.05)，2 mmol/L二甲雙胍干預(yù)后能顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖(P＜0.05);
　　3、0.1μmol/L尼古丁可明顯促進PASMCs中IL-6、TNF-α釋放，在6h時達峰值;二甲雙胍處理后在6h時能顯著降低IL-6、TNF-α的釋放水平(P＜0.05);
　　4、0.1μmol/L尼古丁可顯著誘導(dǎo)PASMCs中 ROS的生成，在1h時達峰值(P＜0.05)，隨后開始下降。而加入二甲

11、雙胍干預(yù)1h后ROS的生成水平明顯降低(P＜0.05);
　　5、0.1μmol/L尼古丁處理PASMCs1 h時，磷酸化AMPK水平顯著升高，隨后逐漸減低，而在各時相點AMPK表達水平無明顯變化。而加入二甲雙胍預(yù)處理PASMCs后，PASMCs中磷酸化AMPK水平在尼古丁處理1h、6h、12h、24 h均持續(xù)活化，12h后磷酸化AMPK水平明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、0.1μmol/L尼古丁誘導(dǎo)P