內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高果糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成中的作用.pdf

1、非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指非酒精所致（每日飲酒量小于10克），以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，其發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢(shì)。NAFLD疾病譜隨病程的進(jìn)展而表現(xiàn)不一，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，大部分患者僅為單純性脂肪肝，也簡(jiǎn)稱為“脂肪肝”。脂質(zhì)合成增多、脂肪酸代謝

2、和運(yùn)輸障礙、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)、線粒體功能異常等是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，而其病理基礎(chǔ)是肝細(xì)胞脂肪變性。當(dāng)肝臟脂質(zhì)合成增加和細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平升高，超過(guò)了脂肪酸的利用（β氧化能力）及極低密度脂蛋白(VLDL)的輸出水平時(shí)，過(guò)多的甘油三酯(TG)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)沉積形成肝細(xì)胞脂肪變性。正常情況下，由乙酰輔酶A從頭合成產(chǎn)生的TG僅為總合成TG的5％，在病

3、理狀態(tài)下，肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成產(chǎn)生的TG可以達(dá)到三分之一。因此，脂質(zhì)從頭合成增多是導(dǎo)致NAFLD脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制。
　　在真核細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及其質(zhì)量監(jiān)控的重要細(xì)胞器。在缺氧、高脂等環(huán)境時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或是錯(cuò)誤折疊蛋白增多，激活細(xì)胞的保護(hù)性措施未折疊蛋白反應(yīng)(unrolded proteinresponse，UPR)，當(dāng)適應(yīng)性機(jī)制仍不能有效清除未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白，超出負(fù)荷時(shí)則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(e

4、ndoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS有三條途徑分別為PKR樣ER調(diào)節(jié)激酶[pancreatic ER kinase(PKR)-like ERkinase，PERK又稱雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶]/真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子-2α（eukaryotic initiation factor-2α，eIF-2α）/活化轉(zhuǎn)錄因子-4(activating transcription factor4，ATF-

5、4)通路，肌醇需酶-1[(inositol requiringenzyme-1，IRE-1)又稱抑制物阻抗性酯酶-1]/X盒結(jié)合蛋白(X-Bindingprotein-1，XBP-1)和活化轉(zhuǎn)錄因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)，最近研究發(fā)現(xiàn)ERS與糖脂代謝密切相關(guān)，可能是導(dǎo)致NAFLD脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制。
　　隨著上世紀(jì)70年代高果糖玉米糖漿(HFCS)引入食品加工業(yè)后，含

6、果糖的食品和軟飲料攝入量增加，臨床和動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)高果糖攝入與人群的肥胖、血脂異常、代謝綜合征、NAFLD相關(guān)。由于高脂飲食是已知的導(dǎo)致NAFLD的重要誘因，我們課題組之前采用高果糖或高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均可誘發(fā)肝內(nèi)脂質(zhì)沉積和高甘油三脂血癥，也證實(shí)短期（1周）和長(zhǎng)期（16周）高果糖喂養(yǎng)均可誘導(dǎo)出小鼠NAFLD模型，出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積，增加了小鼠肝臟內(nèi)源性脂質(zhì)合成率，促進(jìn)脂質(zhì)從頭合成，上調(diào)參與脂質(zhì)從頭合成的上游調(diào)控因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)

7、合蛋白-1c(Sterolregulatory element binding protein-1 c，SREBP-1c)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)及三個(gè)關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和硬脂酰CoA脫飽和

8、酶-1(stearoyl-CoAdesaturase-1，SCD-1)，高脂飲食也可以引起肝臟脂質(zhì)沉積，但是對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響則與高果糖飲食相反，并且高果糖飲食導(dǎo)致ERS出現(xiàn)，因此前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示ERS可能介導(dǎo)高果糖誘導(dǎo)NAFLD脂質(zhì)從頭合成增加的重要機(jī)制。近來(lái)已有大量的文獻(xiàn)證實(shí)了果糖可以導(dǎo)致脂肪肝，并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)或牛磺熊去氧膽酸(taurourso

9、deoxycholate，TUDCA)可以改善肝臟脂質(zhì)沉積，單獨(dú)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑可以導(dǎo)致細(xì)胞TG升高，而另有研究發(fā)現(xiàn)高脂環(huán)境可導(dǎo)致ERS，因此ERS和脂質(zhì)從頭合成之間的相互關(guān)系及果糖促脂質(zhì)從頭合成增加的始動(dòng)機(jī)制尚不明確。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)敲低PERK小鼠可避免高脂環(huán)境誘導(dǎo)的NAFLD，敲低XBP-1可以改善小鼠脂肪肝?？墒怯捎趧?dòng)物研究存在多種干擾因素，目前的研究尚缺乏細(xì)胞水平的對(duì)ERS單條通路在高果糖誘導(dǎo)NAFLD作用機(jī)制中的研究。因此，本研

10、究首先應(yīng)用高果糖(fructose)或高棕櫚酸(palmitic acid，PA)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，觀察細(xì)胞甘油三酯(TG)含量、細(xì)胞脂質(zhì)沉積，其次觀察了果糖和棕櫚酸對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響;再分別應(yīng)用兩種ERS抑制劑和兩種ERS誘導(dǎo)劑，觀察ERS對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響，探討ERS對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響;最后分別利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法靶向上調(diào)和下調(diào)PERK/eIF-2α/ATF-4通路中的ATF-4和IRE-1/XBP-1通路中的XBP-1，觀察

11、單條通路對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成的影響，從而在體外細(xì)胞水平研究高果糖飲食對(duì)脂代謝的危害，探討ERS中單條通路在NAFLD發(fā)生機(jī)制中作用。
　　第一部分果糖和棕櫚酸對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成中的不同影響
　　目的:探討果糖和棕櫚酸(palmitic acid, PA)對(duì)HepG2細(xì)胞甘油三酯的影響及機(jī)制，并確立高果糖造成NAFLD的細(xì)胞模型。
　　方法:采用普通培養(yǎng)基和不同濃度(1、5、20mmol/L)果糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG

12、2細(xì)胞（分別簡(jiǎn)稱為N、F1、F5、F20組），干預(yù)不同時(shí)間(12、24、48、72h)后觀察HepG2細(xì)胞TG水平和脂質(zhì)沉積，采用GPO-PAP法測(cè)定TG，油紅O染色反應(yīng)脂質(zhì)沉積;再使用普通培養(yǎng)基（N組）、20mmol/L果糖干預(yù)72h（簡(jiǎn)稱F組）或0.2mmol/L棕櫚酸干預(yù)24h（簡(jiǎn)稱PA組），測(cè)定各組肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成相關(guān)的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因表達(dá)水平及三個(gè)下游關(guān)鍵酶ACC、FAS和SCD-1的蛋白表達(dá)

13、水平。
　　結(jié)果:1不同濃度果糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞TG水平的影響:應(yīng)用果糖培養(yǎng)HepG2細(xì)胞12小時(shí)，F(xiàn)20組的TG水平明顯高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)1和F5組與N組比較，有升高趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);培養(yǎng)24小時(shí)F20組的TG水平明顯高于N組(P＜0.01)，F(xiàn)5組的TG水平明顯高于N組(P＜0.05)、F1組有升高趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);培養(yǎng)48或72小時(shí)，F(xiàn)5、F20

14、組的TG水平明顯高于N組（均P＜0.01），F(xiàn)1組較N組有升高趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＞0.05)，提示干預(yù)時(shí)間相同，TG隨果糖濃度增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系;果糖濃度相同，TG的水平隨著干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，呈時(shí)間依賴關(guān)系，20mmol/L的果糖，干預(yù)72小時(shí)TG達(dá)到最高值。2不同濃度的果糖培養(yǎng)HepG2細(xì)胞72小時(shí)后對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:油紅O染色顯示N組少見(jiàn)紅染，被油紅染色的大小不一的脂滴隨著果糖濃度增加而增加，F(xiàn)20組紅染脂滴

15、最多。3果糖和棕櫚酸對(duì)細(xì)胞TG水平的影響:F和PA組的肝細(xì)胞TG均較與N組升高（均P＜0.01），兩組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。4果糖和棕櫚酸對(duì)脂質(zhì)從頭合成上游調(diào)控因子和關(guān)鍵酶的影響:F組比N組的肝內(nèi)ChREBP基因表達(dá)增加18倍(P＜0.01)，PA組無(wú)明顯變化，F(xiàn)組比N組的肝內(nèi)SREBP-1c基因表達(dá)增加5倍(P＜0.01)，PA組比N組的肝內(nèi)SREBP-1c基因表達(dá)增加2.4倍(P＜0.01)，比F組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

16、P＜0.01）;F組比N組的肝內(nèi)ACC、FAS、SCD-1蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05），PA組與N組相比無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:1高果糖培養(yǎng)HepG2細(xì)胞可以引起肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積;2肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積程度與果糖的濃度呈劑量依賴性關(guān)系，與干預(yù)時(shí)間呈時(shí)間依賴關(guān)系，20mmol/L的果糖濃度孵育72小時(shí)TG水平達(dá)到最高值，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積最明顯，確定了果糖的干預(yù)濃度為20mmol/L孵育時(shí)間為72小時(shí);3高棕櫚酸培養(yǎng)HepG2細(xì)胞引起脂

17、質(zhì)沉積程度與高果糖一致;4高果糖干預(yù)比高棕櫚酸，明顯促進(jìn)了HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成相關(guān)的上游調(diào)控因子SREBP-1c、ChREBP和下游關(guān)鍵酶ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平。
　　第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響研究
　　目的:分別使用兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA、TUDCA干預(yù)高果糖培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，并分別使用兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicamycin、Thapsigagin干預(yù)HepG2細(xì)胞，觀察ERS對(duì)

18、肝臟內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成的影響。
　　方法:首先分別加入兩種不同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(20mmol/L，簡(jiǎn)稱4-PBA組)、TUDCA（0.2mmol/L，簡(jiǎn)稱TUDCA組）干預(yù)高果糖培養(yǎng)基的HepG2細(xì)胞，之后分別加入兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicamycin(2μg/ml，簡(jiǎn)稱為Tm組)和Thapsigagin(600nmol/L，簡(jiǎn)稱Tg組)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞;最后利用Western的方法測(cè)定各組p-PERK、 p-eIF-

19、2α/eIF-2α、ATF-4、p-IRE-1/IRE-1和XBP-1s，測(cè)定TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積，檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，以及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。
　　結(jié)果:1觀察ERS抑制劑對(duì)ERS的影響:F組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明顯升高（

20、均P＜0.01），TUDCA組p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），p-eIF-2α/eIF-2α、ATF-4均表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），4-PBA組p-PERK、p-eIF-2α/eIF-2α、ATF-4均表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），兩種抑制劑確實(shí)

21、減少了PERK/eIF-2α/ATF-4和IRE-1/XBP-1的兩條通路蛋白表達(dá);2觀察ERS抑制劑對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:TUDCA組TG減少了40％（P＜0.01），油紅O染色顯示較F組脂滴明顯減少，4-PBA組減少50％(P＜0.01)，油紅O染色顯示4-PBA組較F20組脂滴明顯減少;3觀察ERS抑制劑對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:TUDCA組較F組SREBP-1c降低了20％(P＜0.01)，ChREBP降低了15％(P＜0.05)，AC

22、C、FAS、SCD-1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，4-PBA組較F組SREBP-1c降低了40％(P＜0.01)，ChREBP降低了42％(P＜0.05)，ACC降低了33％(P＜0.05)、FAS、SCD-1下降了28％和25％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;4觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)ERS的影響:Tg組的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平較N組明

23、顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)，Tm組較N組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）;5觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)脂質(zhì)沉積的影響:Tg刺激后較N組TG升高了200％(P＜0.01)，Tm刺激后較N組TG升高為180％(P＜0.05)，油紅O染色顯示的Tg和Tm組培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞脂滴明顯增多;6觀察ERS誘導(dǎo)劑對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:與N組比較，Tg組SREBP-1c、ChREBP表達(dá)增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS表達(dá)增加(P＜0.01

24、)，ACC和SCD-1表達(dá)增加(均P＜0.05)，與N組比較，Tm組SREBP-1c、ChREBP表達(dá)增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS、ACC和SCD-1表達(dá)增加（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:1高果糖培養(yǎng)HepG2細(xì)胞可引起ERS;兩種ERS抑制劑4-PBA和TUDCA均可以降低高果糖所致HepG2細(xì)胞內(nèi)TG水平的升高，減輕HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積，抑制高果糖誘導(dǎo)的SREBP-1c、ChREBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的

25、蛋白表達(dá)水平的增加，因此提示ERS與脂質(zhì)從頭合成密切相關(guān);2應(yīng)用兩種ERS誘導(dǎo)劑Tunicmycin和Thapsigargin引起ERS，使肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積增多，顯著增加肝臟脂質(zhì)合成酶的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c、ChREBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表達(dá)水平，因此提示ERS可能參與脂質(zhì)從頭合成增多所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。
　　第三部分 IRE-1/XBP-1信號(hào)通路對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響
　　目的:

26、探討敲低XBP-1或過(guò)表達(dá)XBP-1s對(duì)HepG2細(xì)胞的TG，脂質(zhì)沉積和SREBP-1c、ChREBP、ACC、FAS、SCD-1的影響。
　　方法:首先轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG細(xì)胞XBP-1的shRNA，分為四組:正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱N組）、高果糖組（簡(jiǎn)稱F組）、高果糖+陰性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱F+NC組）、高果糖+XBP-1 shRNA組（簡(jiǎn)稱F+ XBP-1 shRNA組），再分別轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG細(xì)胞XBP-1s和XBP-1u的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，分為

27、四組:未轉(zhuǎn)染組（簡(jiǎn)稱Untransfection組）、陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱pcDNA3.1(+)組）、XBP-1u上調(diào)組[簡(jiǎn)稱pcDNA3.1(+)-XBP-1u組]、XBP-1s上調(diào)組[簡(jiǎn)稱pcDNA3.1(+)-XBP-1s上調(diào)組]，測(cè)定各組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積，檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，以及下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平

28、。
　　結(jié)果:1轉(zhuǎn)染XBP-1 shRNA對(duì)XBP-1s的影響:F+XBP-1 shRNA組的XBP-1s的表達(dá)水平比F組都顯著降低大于70％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明XBP-1s表達(dá)水平被有效抑制;2轉(zhuǎn)染XBP-1 shRNA對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:F+XBP-1 shRNA組TG比F組降低了34％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），油紅O染色示脂滴減少，F(xiàn)+NC組TG無(wú)變化(P＞0.05)，油紅O染色示大量紅

29、染，與F組無(wú)明顯差異;3轉(zhuǎn)染XBP-1shRNA對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:F+XBP-1 shRNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了40％(P＜0.01)，ChREBP無(wú)明顯變化(P＞0.05)，ACC的蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），F(xiàn)AS、SCD-1的蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）;4轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)IRE-1/XBP-1的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組的活性XBP-1s表達(dá)水平比untrans

30、fection組、pcDNA3.1(+)組、pcDNA3.1(+)-XBP-1u組顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），XBP-1u和p-IRE-1/IRE-1水平比pcDNA3.1(+)-XBP-1u組明顯降低(P＜0.05)，提示活性的XBP-1s被有效過(guò)表達(dá)，XBP-1s與XBP-1u、IRE-1符合負(fù)反饋調(diào)控;5轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組TG升高50％，差異

31、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴增多;6轉(zhuǎn)染XBP-1s過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:pcDNA3.1(+)-XBP1s組SREBP-1c的基因水平的表達(dá)增加(P＜0.01)，ACC、SCD-1的蛋白表達(dá)增加（均P＜0.01），F(xiàn)AS的蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，ChREBP無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:1轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG2細(xì)胞XBP-1的shRNA后，高果糖所誘導(dǎo)的甘油三脂沉積可以被緩解，同時(shí)，SREBP-1c和A

32、CC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平有所下降，提示IRE-1/XBP-1通路與脂質(zhì)從頭合成有關(guān);2上調(diào)HepG2細(xì)胞XBP-1s后，可以引起甘油三脂沉積，SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1表達(dá)水平增加，提示SREBP-1c可能是IRE-1/XBP-1通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的重要靶點(diǎn)，而ChREBP可能并未參與該過(guò)程。
　　第四部分 PERK/eIF-2α/ATF-4信號(hào)通路對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響究
　

33、　目的:探討敲低或過(guò)表達(dá)ATF-4對(duì)HepG2細(xì)胞的TG，脂質(zhì)沉積和SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1的影響。
　　方法:首先轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG細(xì)胞ATF-4的siRNA，分為四組:正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱N組）、高果糖組（簡(jiǎn)稱F組）、高果糖+陰性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱F+NC組）、高果糖+ ATF-4 siRNA組（簡(jiǎn)稱F+ ATF-4 siRNA組），之后轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG細(xì)胞ATF-4 siRNA的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，分為四組:未

34、轉(zhuǎn)染組（簡(jiǎn)稱Untransfection組）、陰性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱NC組）、ATF-4上調(diào)組（簡(jiǎn)稱ATF-4+組），測(cè)定各組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG水平和油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積，檢測(cè)各組與肝臟脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的基因水平，下游脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶類ACC、FAS、SCD-1以及CHOP。
　　結(jié)果:1轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)ATF-4和CHOP的影響:F+ATF-4 siRNA組ATF-4的表達(dá)水

35、平比F組顯著降低大于70％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明ATF-4表達(dá)水平被有效抑制;轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)CHOP的影響:F+ATF-4 siRNA組CHOP的表達(dá)水平比F組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);2轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:F+ATF-4 siRNA組TG比F組降低了25％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴減少，F(xiàn)+NC組TG無(wú)變化(P＞0.05)，油

36、紅O染色示大量紅染，與F組無(wú)明顯差異;3轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:ATF-4 siRNA組與F組比較SREBP-1c的基因水平降低了28％(P＜0.01)，ChREBP的基因水平降低了20％(P＜0.05)，ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.01）;4轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)ATF-4和CHOP的影響:ATF-4+組ATF-4的表達(dá)水平比untransfection組、NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

37、義（均P＜0.01），提示ATF-4被有效過(guò)表達(dá);CHOP的蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.01）;5轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響: ATF-4+組TG升高40％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，油紅O染色示脂滴增多;6轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成的影響:ATF-4+組SREBP-1c和ChREBP的基因水平的表達(dá)增加（均P＜0.01），ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)增加（均P＜0.05）。
　　

38、結(jié)論:1轉(zhuǎn)染針對(duì)HepG2細(xì)胞ATF-4的干擾siRNA后，高果糖所誘導(dǎo)的甘油三脂沉積可以被緩解，同時(shí)，SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)水平有所下降，提示PERK/eIF-2α/ATF-4通路與脂質(zhì)從頭合成有關(guān);2上調(diào)HepG2細(xì)胞ATF-4后，可以引起甘油三脂沉積，SREBP-1c、ChREBP和ACC、FAS、SCD-1表達(dá)水平增加，SREBP-1c和ChREBP可能共同參與PERK/eIF-2α/A