內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在雙氫青蒿素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、第一部分\ DHA對(duì)肝癌HepG2、前列腺癌PC-3、胃癌SGC7901及結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞增殖抑制的研究
　　 目的：比較雙氫青蒿素（DHA）對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用，以篩選出最敏感的細(xì)胞株進(jìn)行作用機(jī)制的研究。
　　 方法：噻唑藍(lán)（MTT）比色法評(píng)價(jià)DHA對(duì)人肝癌HepG2，前列腺癌PC-3，胃癌SGC7901及結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DHA對(duì)上述四種細(xì)胞凋亡率的影響。
　　

2、 結(jié)果：四種細(xì)胞的各對(duì)照組與DMSO組之間細(xì)胞增殖比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；DHA對(duì)每種細(xì)胞的抑制率與DHA濃度和作用時(shí)間正相關(guān)（P<0.05），相同時(shí)間，HepG2各濃度組的抑制率與其他三種細(xì)胞相應(yīng)濃度組比較有明顯差異（P<0.01，除外25μmol/L DHA24h組P<0.05）；作用24h后，每種細(xì)胞株各DHA濃度組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。四種細(xì)胞株中，DHA對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其中DH

3、A（200μmol/L）作用48h時(shí)達(dá)最高增殖抑制率（86.46±19.65）％，DHA（100μmol/L）作用24時(shí)達(dá)最高凋亡率（31.74±2.80）％。
　　 結(jié)論：DHA明顯抑制四種細(xì)胞株的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其中HepG2最為敏感。
　　 第二部分、 DHA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡啟動(dòng)因素的研究
　　 目的：探討DHA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素。
　　 方法：用0、50、100和

4、200μmol/L DHA作用HepG2細(xì)胞6h、24h后，采用熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA）及Fluo-3AM裝載檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量及Ca2+濃度；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位（△Ψm）變化及透射電鏡觀察DHA作用HepG2后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，DHA作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)熒光度值顯著增加（P<0.01），且具有明顯的濃度與時(shí)間依賴性，而具有濃度依賴的胞漿游離

5、Ca2+濃度增加及線粒體膜電位降低均出現(xiàn)在DHA作用24h組；DHA100μmol/L作用24h透射電鏡觀察，可見大量凋亡細(xì)胞及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張?？寡趸瘎㎞AC（5mmol/L）可明顯抑制DHA的上述作用。
　　 結(jié)論：DHA明顯增加細(xì)胞中ROS水平及Ca2+濃度，降低線粒體膜電位，ROS的產(chǎn)生可能位于上游環(huán)節(jié)。
　　 第三部分、 DHA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究
　　 目的：研究DH

6、A誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的內(nèi)在作用機(jī)制。
　　 方法：用DHA、DHA+NAC及DHA+SP600125作用HepG2細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制的效果；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況；掃描電鏡觀察DHA作用后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)CHOP，XBP1及ATF4 mRNA的表達(dá)，蛋白印跡技術(shù)（Western Blot）及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CHOP，p-JNK，Bax及Bcl-2蛋白的表

7、達(dá)。
　　 結(jié)果：DHA對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率與DHA濃度和作用時(shí)間相關(guān)（P<0.05），NAC在24h及48h均可抑制DHA的作用，除JNK的特異性抑制劑SP600125在48h高濃度組（50，100，200μmol/L）對(duì)DHA的作用沒有明顯影響外，在其他組中可部分抑制DHA的作用；DHA組24h細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，且與DHA濃度正相關(guān)（P<0.05），NAC及SP600125均可抑制DHA的作用；電鏡觀察顯示，

8、DHA作用后細(xì)胞表面微絨毛減少和消失，凋亡細(xì)胞可見大小不等球狀的突起及凋亡小體，壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DHA可上調(diào)CHOP，XBPlu、XBPls及ATF4 mRNA的表達(dá)，Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DHA上調(diào)CHOP及Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，NAC可抑制DHA對(duì)上述相關(guān)基因與蛋白的調(diào)節(jié)；Western-Blot在DHA作用6h時(shí)檢測(cè)出JNK的磷酸化，NAC及SP60012

9、5均可抑制p-JNK的表達(dá)。
　　 結(jié)論：DHA激活UPR的三條信號(hào)通路（PERK、AFF6、IRE1），通過激活CHOP，JNK而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑，ROS在這一過程中具有重要的作用。
　　 第四部分、 DHA對(duì)裸鼠人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)抑制的研究
　　 目的：研究DHA對(duì)裸鼠人肝癌HepG2移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 方法：采用皮下接種肝癌HepG2細(xì)胞懸液的方法構(gòu)建裸鼠的移植瘤模型，觀

10、察DHA在體內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及免疫組化檢測(cè)CHOP、Bax、Bcl-2及p-JNK的表達(dá)情況；透射電鏡觀察肝癌組織超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，瘤體積及瘤重量明顯降低（P<0.05），抑瘤率達(dá)50.91％，而對(duì)照組與DHA組裸鼠體重?zé)o明顯差異（P>0.05）；RT-PCR及免疫組化顯示DHA可上調(diào)腫瘤組織中CHOP、Bax的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，差異有