腺苷A1與A2a受體-在體外糖氧剝奪條件下,對反應性膠質(zhì)化的作用有與機制.pdf

1、反應性膠質(zhì)化的主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)增生和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達增加。它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種腦損傷后的修復反應,但過度的膠質(zhì)化反應將形成膠質(zhì)瘢痕進而影響神經(jīng)修復和軸突再生。因此,研究膠質(zhì)化的調(diào)控以減少膠質(zhì)化反應的負面影響顯得尤為重要。
　　 腺苷A1受體(A1R)和A2a,受體(A2aR)是4種腺苷受體(A1、A2a、A2b及A3)中的最主要的2種亞型,它們作用于星形膠質(zhì)細胞后可產(chǎn)生不同效應:A1R拮抗劑可部分抑制ATP對

2、膠質(zhì)化反應的誘導作用,提示A1R可能抑制反應性膠質(zhì)化;而在A2aR的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),A2aR基因敲除小鼠的GFAP表達減少;A2aR拮抗劑Sch58261可部分逆轉(zhuǎn)bFGF對膠質(zhì)化反應的誘導作用。這些體內(nèi)外研究提示A2aR可能誘導反應性膠質(zhì)化,具有與A1R相拮抗的作用。缺血缺氧損傷后,A1R與A2aR是否參與膠質(zhì)化?其機制如何?此外,體內(nèi)外研究證實,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中A1R與A2aR可產(chǎn)生相互拮抗的生物學作用,如腦缺血后A1R具

3、有神經(jīng)保護作用,而A2aR對神經(jīng)修復具有損傷作用。那么在缺血缺氧后的反應性膠質(zhì)化中,二者是否可產(chǎn)生相互拮抗的作用?二者是否存在相互作用?均尚未見報道。
　　 為了探討上述問題,本課題通過星形膠質(zhì)細胞的糖氧剝奪建立體外缺血缺氧模型,采用Western blot、基因轉(zhuǎn)染以及免疫共沉淀等實驗方法,觀察A1R與A2aR在缺血缺氧/再灌條件下對反應性膠質(zhì)化的影響,并探討與之相關(guān)的信號通路。此外,本課題還初步探討了A1R與A2aR之間的相

4、互作用及其相關(guān)的信號通路,以期能夠為反應性膠質(zhì)化的調(diào)控及其機制提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分腺苷A1受體在反應性膠質(zhì)化中的作用及其機制
　　 目的研究體外糖氧剝奪后A1R在反應性膠質(zhì)化中的作用及其相關(guān)的信號通路方法培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞系RBA-2細胞,以GFAP表達作為膠質(zhì)化反應的生物學標志;采用Western blot方法,觀察A1R激動劑CPA與拮抗劑DPCPX在糖氧剝奪基礎(chǔ)后對GFAP表達影響,并用Western

5、blot方法初步探討Akt以及Jak2/STAT3信號通路的改變。
　　 結(jié)果糖氧剝奪后,A1R激動劑CPA能抑制RBA-2細胞中GFAP蛋白表達,A1R拮抗劑DPCPX可逆轉(zhuǎn)CPA對GFAP表達的影響;CPA呈劑量依賴性上調(diào)p-Akt水平,而DPCPX預處理可抑制CPA對p-Akt的影響。阻斷Akt可上調(diào)GFAP表達,并逆轉(zhuǎn)CPA對GFAP蛋白表達的抑制作用。CPA作用于RBA-2細胞后,可使p-Jak2水平下降但對p-STA

6、T3水平無明顯影響。阻斷Akt可上調(diào)p-Jak2水平,并逆轉(zhuǎn)CPA對p-Jak2的抑制作用。
　　 小結(jié)糖氧剝奪基礎(chǔ)后,A1R通過Akt磷酸化抑制膠質(zhì)化反應,且Akt與Jak2信號通路間存在crosstalk。
　　 第二部分腺苷A2a受體在反應性膠質(zhì)化中的作用及其機制
　　 目的研究體外糖氧剝奪后,A2aR在反應性膠質(zhì)化中的作用及相關(guān)的信號通路(Akt/NF-κB)。
　　 方法將真核表達質(zhì)粒pEYFP

7、-A2aR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至RBA-2細胞中,篩選出A2aR高表達克隆(A2aR+細胞);采用Western blot和FACS,分別檢測A2aR+細胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的RBA-2細胞(A2aR-細胞)GFAP表達和細胞周期。A2aR的抑制劑Sch58261,Akt抑制劑單獨使用或二者合用后,觀察A2aR+細胞的GFAP表達和細胞周期;用Western Blot檢測Sch58261對Akt信號通路的影響,并觀察阻斷Akt后,Sch58261對GF

8、AP表達、細胞周期以及NF-κB信號通路的影響。
　　 結(jié)果Western blot和FACS結(jié)果顯示,在常氧和糖氧剝奪條件下A2aR轉(zhuǎn)染均可使GFAP表達上調(diào)以及S期細胞比例增加,該作用在糖氧剝奪后更明顯。A2aR阻斷劑Sch58261可抑制GFAP蛋白表達并降低S期細胞比例,Sch58261還可呈劑量依賴性上調(diào)p-Akt水平;阻斷Akt可逆轉(zhuǎn)Sch58261對GFAP蛋白表達和細胞周期的影響。Western blot結(jié)果還顯

9、示,Sch58261下調(diào)A2aR+細胞胞漿中的P65但上調(diào)胞核中P65水平,且A2aR+細胞胞漿中p-IκBα/IκBα比值減小,Akt抑制劑可逆轉(zhuǎn)Sch58261對P65和p-IκBα/IκBα的影響。
　　 小結(jié)糖氧剝奪后,A2aR通過Akt去磷酸化誘導膠質(zhì)化反應,該過程與P65蛋白的核轉(zhuǎn)位有關(guān),而后者受p-IκBα/IκBα比值調(diào)控。
　　 第三部分腺苷A1與A2a受體之間的相互作用及其相關(guān)的信號通路
　　

10、 目的研究體外糖氧剝奪后,A1R與A2aR之間的相互作用,并對該作用所涉及的信號通路進行初步探討。
　　 方法培養(yǎng)A2aR+細胞,采用免疫共沉淀的方法,定性檢測A1R與A2aR間的相互作用;采用Western blot方法,檢測糖氧剝奪后A1R拮抗劑DPCPX對A2aR以及GFAP表達的影響并初步探討該作用所涉及的信號通路(Jak2、Akt)。
　　 結(jié)果免疫共沉淀結(jié)果顯示A1R與A2aR間存在相互作用;Western

11、blot結(jié)果顯示糖氧剝奪后,A1R拮抗劑DPCPX呈劑量依賴性上調(diào)A2aR以及GFAP蛋白表達;DPCPX還可抑制A2aR+細胞中p-Akt以及p-Jak2水平。
　　 小結(jié)Akt與Jak2信號分子可能參與調(diào)節(jié)A1R與A2aR間存在相互作用。
　　 結(jié)論
　　 1.體外糖氧剝奪后,A1R通過Akt磷酸化進而抑制膠質(zhì)化。抑制Akt可上調(diào)p-Jak2。提示Akt可能通過p-Jak2介導A1R抑制膠質(zhì)化。