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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:建立星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法以及氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型,研究鹽酸法舒地爾(fasudil hydrochloride,F(xiàn)H)(5μM、10 μM)對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
方法:采用新生1~3天SD 大鼠進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底85%~90%時(shí),即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。取傳一代后生長(zhǎng)至第五天的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)
2、驗(yàn)。應(yīng)用氧清除劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4),聯(lián)合孵育液缺糖的方法建立星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD 損傷模型,通過(guò)噻唑藍(lán)(thiazoyl blue tetrazolium bromide,MTT)染色法和檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的釋放量來(lái)評(píng)價(jià)星形膠質(zhì)細(xì)胞受損傷程度,并觀察FH(5μM,10 μM)預(yù)孵育對(duì)OGD 損傷的保護(hù)作用。采用高效液相色譜(high performance liquidchro
3、matography,HPLC)熒光檢測(cè)法測(cè)定培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞外液中谷氨酸(glumaticacid,Glu)、甘氨酸(glycine,Gly)、?;撬幔╰aurine,Tau)及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)的含量;利用2',7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate,DCFH-DA)熒光探針來(lái)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中活性氧簇(reactive oxygen
4、species,ROS)含量的變化來(lái)探討FH 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。
結(jié)果:1.MTT分析:以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%,OGD 造模組星形膠質(zhì)細(xì)胞的百分活力下降到正常對(duì)照組的24%,兩組間差異有極顯著性意義(p<0.01);FH 低劑量組與高劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞百分活力分別為正常對(duì)照組的41.2%和41.5%,較OGD 造模組均上升,且差異均有極顯著性意義(p<0.01);但FH 低劑量組和高劑量組間比較無(wú)顯著性
5、差異(p>0.05)。2.LDH 釋放量:正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量LDH 釋放,OGD 造模組星形膠質(zhì)細(xì)胞的LDH 釋放量顯著增加,約為正常對(duì)照組的2.1倍,與正常對(duì)照組相比差異有極顯著性意義(p<0.01);FH 低劑量組與高劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH 釋放量與OGD模型組比均下降,且差異均有極顯著性意義(p<0.01);且 FH 降低LDH 釋放量的作用呈劑量依賴(lài)性(p<0.05)。3.星形膠質(zhì)細(xì)胞外液中氨基酸含量測(cè)定:OGD造模組
6、四種氨基酸含量較正常組均顯著增高(p<0.01),且興奮性氨基酸Glu 增高的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Gly,Tau,GABA 這三種抑制性氨基酸;與OGD 造模組相比,F(xiàn)H 低劑量組和高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)外液中氨基酸含量均顯著降低(p<0.01),且Glu 降低最為顯著;但FH 低劑量組和高劑量組間比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)。4.星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化:造模組ROS 生成較正常組明顯增多;FH 不同劑量給藥組同造模組相比,可明顯抑制RO
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