法舒地爾對氧化樂果染毒大鼠心股細(xì)胞的保護作用及機制的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1.采用急性氧化樂果(Omemoate)中毒大鼠模型,研究法舒地爾(HA1077)對中毒后心肌損害的保護作用及機制。
　　 2.采用氧化樂果染毒的離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型,觀察法舒地爾對染毒離體心肌細(xì)胞的影響及其可能機制。
　　 方法：
　　 第一部分:法舒地爾對急性氧化樂果中毒大鼠心肌損害的保護作用及機制
　　 1.40只雄性SD大鼠隨機分4組(n=10):正常對照組(NC組)、中毒組

2、(PC組)、阿托品治療組(AT組)、法舒地爾邯可托品治療組(UN組)。
　　 2.采用腹腔注射氧化樂果(160mg/kg)制作中毒模型。染毒后3min,AT組、UN組給予阿托品(10mg/kg)肌肉注射,之后根據(jù)大鼠流涎、瞳孔大小等情況確定阿托品用藥次數(shù);其中,UN組在注射阿托品后即刻又給予法舒地爾腹腔注射、繼而以q8h維持治療;對應(yīng)時間點,AT組和PC組腹腔注射等容積的生理鹽水。NC組僅給予等容積的生理鹽水腹腔注射。各組實驗動

3、物觀察48h后脫頸處死或者中毒死亡后立即開胸取出心臟留取標(biāo)本。
　　 3.采用HE染色、Tunel法,免疫組化染色,觀察各組心肌標(biāo)本的病理學(xué)改變、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bcl-2、Bax蛋白表達水平的變化情況。
　　 第二部分:法舒地爾對氧化樂果染毒大鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞的影響及其機制
　　 1.在Langendorff裝置上,用膠原蛋白酶逆灌注分離出雄性SD大鼠心肌細(xì)胞(CM),DMEM中常規(guī)培養(yǎng)。
　　 2.按

4、培養(yǎng)基中氧化樂果劑量,分為低劑暈中毒組(LP)、中劑量中毒組(MP)和高劑量中毒組(HP)。培養(yǎng)12h,根據(jù)各組CM的存活率,選取理想的劑量進一步實驗。
　　 3.按培養(yǎng)基中法舒地爾劑量,分為低劑量法舒地爾組(LH)、中劑量法舒地爾組(MH)和高劑量法舒地爾組(HH)。培養(yǎng)12h,根據(jù)各組CM的存活率,選擇最佳法舒地爾劑量進一步實驗。
　　 4.根據(jù)CM的存活率結(jié)果,選擇正常對照組(NC)、MP組、MH組進行以下實驗。在

5、3h、6h、12h及24h時,測定各組CM的收縮幅度。培養(yǎng)12h,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞蛋白,測定培養(yǎng)基中的LDH含量及心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:法舒地爾對急性氧化樂果中毒大鼠心肌損害的保護作用及機制
　　 1.各中毒組大鼠生存狀況和中毒癥狀的變化
　　 PC組大鼠于染毒后29±6.3 min全部死亡。在染毒后48 h,UN組9只大鼠存活,1只于第28 h

6、死亡;AT組7只存活,3只死亡(死亡時間,23.3±2.1 h)。與AT組比較,UN組大鼠中毒程度減輕,癥狀消失時間提前,其中肌力、肌顫差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.各組大鼠心肌AI變化
　　 與NC組比較,AT組、UN組心肌AI顯著升高(P＜0.01),PC組心肌AI略有升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與AT組比較,UN組心肌AI顯著降低(P＜0.01)。
　　 3.各組大鼠心肌組織的Bax、Bcl-

7、2蛋白表達的變化
　　 與NC組比較,AT組、UN組心肌組織的Bax蛋白表達增加、Bcl-2蛋白表達減少、Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.01),PC組心肌組織的Bcl-2蛋白表達明顯減少(P＜0.05),Bax蛋白表達增加、Bax/Bcl-2比值升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義;與AT組比較,UN組心肌組織的Bax蛋白表達減少,Bcl-2蛋白表達增加,Bax/Bcl-2比值下降(P＜0.01)。
　　 4.各組大鼠心肌組織的病

8、理形態(tài)學(xué)變化
　　 PC組可見血管充血明顯,間質(zhì)水腫,未見肌纖維紊亂、壞死灶等。AT組可見心肌間質(zhì)水腫、血管充血、炎癥細(xì)胞浸潤、肌纖維紊亂、局灶性肌纖維斷裂、溶解壞死灶等。與AT組比較,UN組病理病變明顯減輕,未見壞死灶。NC組心肌組織結(jié)構(gòu)清晰,未見異常。
　　 第二部分:法舒地爾對氧化樂果染毒大鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞的影響及其機制
　　 1.中毒組間CM存活率的變化
　　 與NC組比較,各中毒組CM存活率均有顯

9、著地降低(P＜0.01):中毒劑量越高,CM存活率越低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.HA1077組間CM存活率的變化
　　 與MP組比較:LH組和MH組CM存活率明顯升高(P＜0.05 or P＜0.01);HH組存活率略下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.各組CM收縮幅度的變化
　　 與NC組比較,MP組和MH組CM收縮幅度在各個時間點明顯減小(P＜0.01)。與MP組比較,MH組C

10、M收縮幅度增大,12h時最為明顯(P＜0.01)。
　　 4.各組培養(yǎng)基LDH含量的變化
　　 與NC組比較,MP組和MH組LDH明顯升高(P＜0.01)。但與MP組比較,MH組LDH含量降低(P＜0.01)。
　　 5.各組CM中Bax、Bcl-2蛋白的表達
　　 與NC組比較,MP組和MH組心肌細(xì)胞Bax蛋白表達增加、Bcl-2蛋白表達減少,Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.01);與MP組比較,M

11、H組心肌細(xì)胞Bax蛋白表達減少、Bcl-2蛋白表達增加,Bax/Bcl-2比值下降(P＜0.01)
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:
　　 ①法舒地爾對急性氧化樂果中毒大鼠的心肌損害有保護作用,可降低急性氧化樂果中毒大鼠的死亡率。
　　 ②抑制Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達,降低Bax/Bcl-2蛋白的比值,進而抑制心肌細(xì)胞凋亡是法舒地爾對氧化樂果染毒后心肌損害起保護作用的重要機制之一。