法舒地爾對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦白質(zhì)保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:
　　 近年來(lái)，由于缺血性腦血管病所造成的神經(jīng)功能障礙已成為影響中老年人生活質(zhì)量的重要因素。隨著影像技術(shù)的進(jìn)展，腦白質(zhì)的損傷及危害越來(lái)越多的為我們所發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)。引起腦白質(zhì)損傷最常見(jiàn)的原因就是缺血性腦損傷，其次還包括炎癥、神經(jīng)變性疾病、中毒性腦病、創(chuàng)傷及營(yíng)養(yǎng)代謝障礙等。腦白質(zhì)損傷能夠引發(fā)傳導(dǎo)束變性，引起運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)等神經(jīng)活動(dòng)的聯(lián)絡(luò)中斷而導(dǎo)致神經(jīng)功能的障礙。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突及其周?chē)@的髓鞘是構(gòu)成腦白質(zhì)的主要組成部分，因

2、此對(duì)腦白質(zhì)保護(hù)的研究重點(diǎn)在于對(duì)軸突再生及髓鞘重塑的研究。大腦白質(zhì)主要由深穿支動(dòng)脈供血，很容易發(fā)生缺血性損傷，而損傷后的軸突如何恢復(fù)生長(zhǎng)或再生，脫失的髓鞘是否能夠重新包繞軸突，成為目前研究的熱門(mén)。
　　 Nogo-A是一種髓鞘源性抑制蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)軸突生長(zhǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。Nogo-A通過(guò)與受體NgR(Nogoreceptor，一種軸突表面蛋白)相結(jié)合，激活第二信使cAMP和Ca2+，然

3、后激活下游的Rho激酶(Rho-associated kinase，ROCK)。
　　 Rho激酶是小分子GTP酶Rho家族的成員，在細(xì)胞中的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著分子開(kāi)關(guān)的作用，在控制細(xì)胞遷移、細(xì)胞收縮、增殖、細(xì)胞凋亡中起重要作用。因此，抑制Rho激酶的激活具有腦保護(hù)作用。
　　 法舒地爾是一種新型異喹啉磺酰胺衍生物類(lèi)Rho激酶選擇性抑制劑，最早用于改善蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的血管痙攣。法舒地爾通過(guò)對(duì)Rho激酶的特異性抑制

4、參與了多種分子功能，如增加局部腦血流、上調(diào)eNOS的表達(dá)改善血管內(nèi)皮功能、抑制中性粒細(xì)胞的遷移等對(duì)腦梗死產(chǎn)生保護(hù)作用；對(duì)神經(jīng)再生及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用。關(guān)于法舒地爾對(duì)軸突再生的作用國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于脊髓橫斷傷和周?chē)窠?jīng)損傷，而對(duì)腦神經(jīng)研究相對(duì)較少；而關(guān)于法舒地爾對(duì)髓鞘的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分的改變和髓鞘染色的變化，利用免疫組化技術(shù)觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞的

5、特異性標(biāo)記物MBP、軸突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A和Rho激酶的表達(dá)變化，采用法舒地爾進(jìn)行干預(yù)，探討法舒地爾是否對(duì)腦白質(zhì)具有保護(hù)作用及可能的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法:
　　 將72只成年雄性健康SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、缺血再灌注組（對(duì)照組）、法舒地爾干預(yù)組（法舒地爾組），每組24只，根據(jù)再灌注時(shí)間再分為1天、3天、7天、14天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。采用Zea-Longa線(xiàn)栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(mid

6、dle cerebral artery occlusion reperfusion，MCAO/R)模型后，分別于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋，切片，分別進(jìn)行髓鞘染色和免疫組化染色。對(duì)各組存活大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；通過(guò)變色酸2R-亮綠雙重染色法觀察髓鞘形態(tài)變化；免疫組化法觀察MBP、Nogo-A、Rho激酶表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.神經(jīng)功能缺損評(píng)分：對(duì)照組與法舒地爾組較假手術(shù)組在相同時(shí)間點(diǎn)神

7、經(jīng)功能缺損癥狀明顯，評(píng)分較假手術(shù)組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；法舒地爾組與對(duì)照組比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分降低，神經(jīng)功能缺損癥狀有所恢復(fù)，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.髓鞘染色比較：假手術(shù)組髓鞘排列呈條索狀，纖維排列緊密整齊；對(duì)照組髓鞘纖維斷裂、排列紊亂、疏松、有空泡形成。法舒地爾組與對(duì)照組比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)髓鞘排列明顯變整齊，空泡消失，有少量斷裂。
　　 3.免疫組化結(jié)果比較：

8、　　 3.1 MBP表達(dá)的變化：
　　 3.1.1觀察缺血側(cè)白質(zhì)區(qū)MBP陽(yáng)性纖維的變化：假手術(shù)組大鼠左側(cè)白質(zhì)區(qū)可見(jiàn)密度較高的MBP陽(yáng)性纖維分布，排列整齊致密；對(duì)照組和法舒地爾組MBP陽(yáng)性纖維疏散，排列紊亂。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，MBP表達(dá)陽(yáng)性纖維密度較前增大，排列漸趨于整齊。兩組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組積分光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。法舒地爾組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)MBP陽(yáng)性纖維較對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分布增多，著色增強(qiáng)；各時(shí)間點(diǎn)積分光密度

9、值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.1.2 Nogo-A蛋白表達(dá)的變化：假手術(shù)組大鼠左側(cè)海馬可見(jiàn)少量Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞分布；對(duì)照組、法舒地爾組在再灌注后1天、3天、7天的Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞呈遞增式增多，著色加深，14天開(kāi)始下降，但仍高于假手術(shù)組水平；法舒地爾組Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.1.3 Rho表達(dá)的變化：假手術(shù)組大鼠左

10、側(cè)海馬區(qū)可見(jiàn)少量Rho陽(yáng)性細(xì)胞分布；對(duì)照組、法舒地爾組Rho陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在再灌注后1天即開(kāi)始增多，3天繼續(xù)上升，達(dá)到高峰，7天開(kāi)始下降，但仍高于假手術(shù)組水平；法舒地爾組Rho陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、法舒地爾能夠降低缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。
　　 2、法舒地爾能夠減輕急性缺血后的髓鞘脫