草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生與法舒地爾保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、梗阻性腎病中最為常見(jiàn)的病因?yàn)槊谀蛳到Y(jié)石，且隨著生活水平的提高，結(jié)石的發(fā)病率也不斷攀升，左、右腎結(jié)石的發(fā)病率相當(dāng)，雙腎結(jié)石的發(fā)病率約7％-10％，其中草酸鈣結(jié)石占腎結(jié)石的比例約為80％。腎結(jié)石對(duì)人體產(chǎn)生的危害不僅局限于梗阻，結(jié)石形成后所致的腎功能不全對(duì)人群影響更為嚴(yán)重，而其介導(dǎo)的腎損害的發(fā)生機(jī)制仍不明確，與此同時(shí)，為尋找新的治療措施，本文擬觀察草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型中腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生情況，并探討相關(guān)的治療藥物及其可能的作用機(jī)制，為

2、臨床醫(yī)學(xué)提供新的治療途徑。
　　 第一部分:草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生與ROCK1變化
　　 [目的]研究乙醛酸鹽誘導(dǎo)所致草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型小鼠EMT的發(fā)生情況并觀察ROCK1的表達(dá)情況。
　　 [方法]選擇C57BL/6J小鼠連續(xù)腹腔注射乙醛酸鹽建立草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取腎臟組織，應(yīng)用HE染色及馮庫(kù)薩染色分別觀察腎臟結(jié)構(gòu)變化及鈣鹽沉積情況，并應(yīng)用免疫熒光雙染標(biāo)記監(jiān)測(cè)EMT的

3、發(fā)生情況，同時(shí)應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測(cè)ROCK1的表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]隨著連續(xù)腹腔注射乙醛酸鹽時(shí)間的延長(zhǎng)，模型小鼠腎臟HE染色結(jié)果顯示，近端腎小管管腔逐漸可見(jiàn)具有折光性的不規(guī)則晶體的粘附，且腎小管上皮細(xì)胞逐漸出現(xiàn)腫脹及變形，基底膜逐漸裸露;馮庫(kù)薩染色顯示近端小管腔內(nèi)黑色鈣鹽沉積逐漸增加;免疫熒光雙染、RT-PCR、Western blot結(jié)果均顯示腎小管上皮標(biāo)志E-cadherin及Pan-ck逐漸丟

4、失，而間質(zhì)標(biāo)志α-SMA及Vimentin的表達(dá)則逐漸增加，此外，RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示隨著乙醛酸鹽干預(yù)的增強(qiáng)，ROCKI表達(dá)也逐漸增加，且在干預(yù)第三天即達(dá)高峰并維持。
　　 [結(jié)論]乙醛酸鹽誘導(dǎo)所致草酸鈣結(jié)晶腎損傷模型早期即存在EMT，啟動(dòng)了纖維化的進(jìn)程，并有Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。
　　 第二部分:Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對(duì)草酸鈣結(jié)晶腎損傷的干預(yù)作用
　　 [目

5、的]觀察Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶性腎損傷的干預(yù)效應(yīng)。
　　 [方法]選取C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純乙醛酸鹽組、乙醛酸鹽加法舒地爾組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取腎臟組織，應(yīng)用HE染色、馮庫(kù)薩染色、苦味酸-天狼星紅、免疫組化、RT-PCR、Western-blot檢測(cè)Rock特異性抑制劑法舒地爾的干預(yù)效應(yīng)。
　　 [結(jié)果]三組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較顯示，乙醛酸鹽加法舒地爾組與正常對(duì)照組相比，其腎組

6、織結(jié)夠稍有破壞，鈣鹽有所沉積并出現(xiàn)了少許的纖維化，上皮標(biāo)志E-cadherin及Pan-ck的表達(dá)有所下降，間質(zhì)標(biāo)志α-SMA及Vimentin亦有少量的表達(dá)，此外PAI-1、OPN、CD44及ROCK1的表達(dá)亦有所增加;而與單純乙醛酸鹽組相比，其腎組織結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，鈣鹽沉積有所減少，α-SMA、Vimentin、PAI-1、OPN、CD44及ROCK1的表達(dá)明顯減少，同時(shí)E-cadherin、Pan-ck表達(dá)有所增加，腎纖維化程度

7、明顯緩解。
　　 [結(jié)論]Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶性腎損傷具有保護(hù)效應(yīng)。
　　 第三部分:法舒地爾對(duì)草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護(hù)機(jī)制
　　 [目的]探討法舒地爾對(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶性腎損傷保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 [方法]選取C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純乙醛酸鹽組、乙醛酸鹽加法舒地爾組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取腎臟組織，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)各組小鼠smad2、smad

8、3、p-smad2、p-smad3及PAI-1的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖及凋亡情況。
　　 [結(jié)果] Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，三組中smad2及smad3的表達(dá)無(wú)明顯差異，而PAI-1、p-smad2及p-smad3于乙醛酸鹽加法舒地爾組中其表達(dá)雖較正常對(duì)照組有所增加，但與單純乙醛酸鹽組相比其表達(dá)則明顯減弱。PCNA及Tune(l)檢測(cè)顯示，乙醛酸鹽加法舒地爾組與正常對(duì)照組相比其細(xì)胞凋亡有所增