長(zhǎng)鏈非編碼RNAs調(diào)控草酸鈣結(jié)晶腎損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腎結(jié)石是梗阻性腎病常見(jiàn)原因之一，其發(fā)病率每年攀升。腎結(jié)石是微結(jié)晶集聚組成的，其中80％是草酸鈣。草酸鈣結(jié)晶腎小管上皮細(xì)胞損傷是腎結(jié)石的早期表現(xiàn)，是同一疾病不同發(fā)展階段。因此研究腎結(jié)石靶定在早期階段有助于預(yù)防疾病的發(fā)生。結(jié)晶在腎小管的沉積會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷，最終進(jìn)展為終末期腎病。
　　伴隨腎功能下降的腎結(jié)石患者發(fā)生腎間質(zhì)纖維化，這一過(guò)程是多數(shù)腎臟疾病最終病理結(jié)果。大量研究表明腎間質(zhì)纖維化常可引起腎臟上皮細(xì)胞表型逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型，

2、就是所謂上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)。文獻(xiàn)報(bào)道，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能與細(xì)胞增殖是相關(guān)的。例如:在體外，TGF-β1刺激小鼠腎小管上皮細(xì)胞抑制在G2/M期和產(chǎn)生能夠促使周細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞的促纖維化細(xì)胞因子。在體內(nèi)腎臟纖維化小鼠模型中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是纖維化損傷的啟動(dòng)因素，抑制細(xì)胞周期在G2期。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRN

3、As)是近年來(lái)學(xué)者們爭(zhēng)相研究熱點(diǎn)，它是非編碼RNAs的一種類(lèi)型，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(Nucleotides，nt)，幾乎沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)能力。研究表明lncRNAs在生物學(xué)進(jìn)程中扮演重要角色，如調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等。此外，人類(lèi)很多疾病中發(fā)現(xiàn)lncRNAs表達(dá)異常并且參與疾病進(jìn)展，例如直腸癌，前列腺癌，腎癌，梗阻性腎病。
　　目前，lncRNAs在腎結(jié)石領(lǐng)域研究甚少，而EMT是腎結(jié)石伴隨腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵啟動(dòng)因素之一。提出假設(shè)

4、lncRNAs是通過(guò)調(diào)節(jié)EMT影響腎結(jié)石發(fā)生發(fā)展。本課題應(yīng)用lncRNAs和mRNAs芯片檢測(cè)正常小鼠腎組織和結(jié)晶組小鼠腎組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs表達(dá)譜差異。通過(guò)人鼠同源性對(duì)比，篩選出人的lncRNAs及其可能調(diào)控基因，并進(jìn)一步探討其在腎結(jié)石中作用和機(jī)制，為將來(lái)深入研究提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　利用基因芯片和人鼠同源性分析篩選確定lncRNA-CHCHD4P4。探討CHCHD4P4在結(jié)晶腎損傷過(guò)程中的生物學(xué)功能

5、和分子調(diào)控機(jī)制，為將來(lái)臨床防治腎結(jié)石提供分子靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.用Agilent8×60K小鼠全基因組芯片對(duì)3只結(jié)晶組和3只對(duì)照組小鼠腎組織進(jìn)行mRNAs和lncRNAs差異基因篩選，差異基因表達(dá)分析中采用Limma算法，篩選條件是Fold Change＞1.5，P＜0.05?；诓町恗RNAs做了基因功能分析(GO)及信號(hào)通路分析(KEGG Pathway)，得到顯著上調(diào)的GO-Term和顯著下調(diào)的GO-Term及

6、其包含的基因，及顯著上調(diào)的Pathway和顯著下調(diào)的Pathway及其包含的基因。
　　2.采用人鼠同源性序列比對(duì)，獲得與鼠同源性人的lncRNAs。采用Real-time PCR(RT-PCR)技術(shù)，在一水草酸鈣(COM)刺激人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)體外模型中驗(yàn)證CHCHD4P4表達(dá)水平。
　　3.CHCHD4P4體外功能研究:選用HK-2細(xì)胞作為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染CHCHD4P4 SiRNA抑制CHCHD4P4表達(dá)水平或

7、者轉(zhuǎn)染CHCHD4P4-pcDNA3.1過(guò)表達(dá)CHCHD4P4表達(dá)水平。體外分別用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)，免疫熒光，免疫印跡法檢測(cè)上皮間質(zhì)標(biāo)志物。對(duì)于細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)行為采用CCK8，Edu，流式細(xì)胞儀等檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.微陣列芯片結(jié)果顯示差異表達(dá)lncRNAs共376條，其中結(jié)晶組表達(dá)上調(diào)154條，下調(diào)222條;差異表達(dá)mRNAs共2165條，上調(diào)1421條，下調(diào)744條。
　　2.人鼠同源性篩

8、選出15對(duì)，RT-PCR驗(yàn)證獲得人源lncRNA是CHCHD4P4，鼠源lncRNA是AU015836，二者在結(jié)晶組模型中均高表達(dá)。
　　3.在體外模型中，CHCHD4P4相對(duì)對(duì)照組高表達(dá)。結(jié)晶組上皮表型E-cadherin表達(dá)減少，而間質(zhì)表型vimentin，snail，ZEB1表達(dá)增加。同時(shí)結(jié)晶組細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡水平增強(qiáng)，而細(xì)胞周期基本沒(méi)有變化。
　　結(jié)論：
　　1.在體外，COM刺激HK-2細(xì)胞模型中發(fā)生E

9、MT現(xiàn)象，與前期我們團(tuán)隊(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)小鼠結(jié)晶腎損傷模型結(jié)果一致。
　　2.結(jié)晶組相對(duì)對(duì)照組，CHCHD4P4高表達(dá)。CHCHD4P4 SiRNA可減弱上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變過(guò)程，而CHCHD4P4-pcDNA3.1可加快EMT發(fā)生。
　　3.在結(jié)晶組，CHCHD4P4可抑制細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，不改變細(xì)胞周期。
　　4.在結(jié)晶腎損傷模型中，CHCHD4P4可能通過(guò)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。CH