自噬對大鼠腎臟草酸鈣晶體形成的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　腎結(jié)石是在我國泌尿外科是一種常見病及多發(fā)病，最近一項(xiàng)覆蓋全國的大規(guī)模的橫斷面流行病學(xué)研究表明中國成年人腎結(jié)石患病率為5.8％，結(jié)合我國中國巨大的人口基數(shù)，目前中國約有6120萬成年人罹患腎結(jié)石。該研究同時也表明在我國結(jié)石主要集中在華南及西南地區(qū)，這與南方的平均氣溫比北方高有關(guān)。腎結(jié)石同時也是全球性疾病，國外多項(xiàng)研究表明在約有5-15%的居民會罹患腎結(jié)石。在所有腎結(jié)石患者中，大約80%腎結(jié)石成分為含鈣結(jié)石，其中草酸

2、鈣結(jié)石是最常見的腎結(jié)石類型，所占比例約為70%-80%。隨著最近幾年腔內(nèi)微創(chuàng)技術(shù)在泌尿系結(jié)石治療方面取得巨大成功，腎結(jié)石患者也因此受益匪淺，但是草酸鈣結(jié)石的發(fā)病因素包括遺傳、環(huán)境、飲食、疾病和代謝等多個方面，其確切病因仍不清楚并且缺乏有效的預(yù)防措施，其在治療后復(fù)發(fā)率仍然很高，大多數(shù)患者一生中因?yàn)槟I結(jié)石復(fù)發(fā)需要接受多次治療，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，同時也給個人及社會都帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，進(jìn)一步揭示草酸鈣結(jié)石的確切發(fā)病機(jī)制，尋

3、找新的有效干預(yù)靶點(diǎn)，具有重要的科研和臨床價值。
　　【研究目的】
　　研究自噬對大鼠腎臟草酸鈣晶體形成的影響及可能的作用機(jī)制
　　【研究方法】
　　取健康雄性SD大鼠40只，體重約為200±6.3g，隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為對照組、造模組、氯喹干預(yù)組、雷帕霉素干預(yù)組。大鼠腎結(jié)石模型建立方法：自由飲用1%乙二醇28天+1%氯化銨灌胃（2ml/天/只）6天。氯喹干預(yù)組采用氯喹溶液（40mg/kg/day）腹腔

4、注射，雷帕霉素干預(yù)組采用雷帕霉素溶液（0.5mg/kg/day）腹腔注射。連續(xù)飼養(yǎng)28天后，收集大鼠24小時尿液并分析其成石危險相關(guān)成分的含量。取大鼠雙側(cè)腎臟，應(yīng)用免疫組化及透射電鏡方法檢測各組大鼠腎臟自噬水平，并且通過透射電鏡觀察線粒體形態(tài)。通過免疫組化方法檢測各組大鼠腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激損傷相關(guān)標(biāo)志物。
　　【研究結(jié)果】
　　1.各組大鼠尿液24小時尿危險成分分析
　　與對照組相比，模型組大鼠尿草酸排泄量明顯升高（P＜0

5、.05），而尿枸櫞酸排泄量明顯降低（P＜0.05）。與對照組相比，氯喹干預(yù)組大鼠尿 PH值及尿鉀、尿氯、尿鈉、尿尿酸、尿枸櫞酸排泄量均明顯降低（P＜0.05）。與對照組相比，雷帕霉素組大鼠尿氯、尿鉀、尿鈉、尿磷、尿尿酸、尿枸櫞酸排泄量明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，氯喹干預(yù)組大鼠尿PH值及尿鉀、尿氯、尿鈉、尿磷、尿草酸排泄量明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，雷帕霉素組大鼠尿PH值及尿氯、尿鉀、尿鈉、尿磷、尿尿酸、尿枸櫞酸排

6、泄量明顯降低（P＜0.05）。與氯喹干預(yù)組相比，雷帕霉素組大鼠尿尿酸排泄量明顯降低（P＜0.05）,其余尿液指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.各組大鼠腎臟草酸鈣晶體形成情況
　　對照組大鼠腎臟無可見草酸鈣晶體，而造模組大鼠腎小管內(nèi)可見大量折光性顯著的草酸鈣晶體。與模型組（32.4±5.1/HP）相比，氯喹干預(yù)組（4.0±0.9/HP）大鼠腎臟草酸鈣晶體顯著減少（P＜0.05），而雷帕霉素干預(yù)組（102.4±8.5/H

7、P）大鼠腎臟草酸鈣晶體則明顯增多（P＜0.05）。
　　3.透射電鏡下各組大鼠腎臟細(xì)胞自噬水平結(jié)果
　　對照組大鼠腎臟內(nèi)可見單個自噬小體，而模型組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)可見多量典型的圓球形單層膜自噬溶酶體，其數(shù)量比對照組明顯增多。氯喹干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)可見單個典型的圓球形單層膜自噬溶酶體。雷帕霉素干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)可見多量自噬溶酶體。
　　4.免疫組化檢測各組大鼠腎臟內(nèi)自噬標(biāo)志物水平
　　與對照組相比，模型組大鼠腎臟

8、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)明顯升高，而自噬標(biāo)志物P62則明顯降低。與模型組相比，氯喹干預(yù)組大鼠腎臟LC3及P62的表達(dá)均明顯升高。與模型組相比，雷帕霉素干預(yù)組大鼠腎臟LC3表達(dá)明顯升高，而P62的表達(dá)明顯降低。
　　5.透射電鏡下各組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)觀察
　　對照組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)可見雙層膜桿狀的線粒體，線粒體內(nèi)、外膜均保持完整，線粒體嵴清晰。模型組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為線粒體腫脹，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)模糊，線粒體

9、嵴數(shù)目減少，排列紊亂。氯喹干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)清晰，與對照組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)相似。雷帕霉素干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯水腫，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)模糊，線粒體嵴數(shù)目減少，排列紊亂。
　　6.免疫組化檢測各組大鼠腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平
　　與對照組相比，模型組腎臟的超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)明顯降低，與對照組相比，而單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）與8-羥化脫氧鳥苷（8-OHdG）的表達(dá)則明顯升高。

10、與模型組相比，氯喹干預(yù)組大鼠腎臟的SOD表達(dá)明顯升高，而MCP-1與8-OHdG的表達(dá)則明顯降低。與對照組相比，雷帕霉素干預(yù)組大鼠腎臟的SOD表達(dá)明顯降低，而MCP-1與8-OHdG表達(dá)則明顯升高。
　　【研究結(jié)論】
　　1.乙二醇誘導(dǎo)的高草酸尿可明顯提高大鼠腎臟內(nèi)的自噬水平。
　　2.本研究首次證實(shí)了自噬在大鼠草酸鈣晶體形成中具有重要的調(diào)控作用，降低大鼠腎臟自噬水平可明顯抑制草酸鈣晶體的形成。
　　3.自噬參與