法舒地爾在骨髓基質干細胞遷移中的作用及其機制研究.pdf

1、目的: 研究Rho激酶抑制劑法舒地爾(HA-1077)和VEGF對大鼠骨髓基質干細胞(BMSCs)及向內(nèi)皮定向分化的BMSCs遷移的影響；研究法舒地爾、VEGF刺激下，BMSCs遷移與ROCK表達及細胞骨架絲狀肌動蛋白(F-actin)和紐蛋白(Vinculin)的關系，分析法舒地爾影響B(tài)MSCs遷移的機制。 方法: 1.采用密度梯度離心法，用密度1.077ml的淋巴細胞分離液，從大鼠骨髓中分離BMSCs，并于體

2、外純化、擴增。 2.EGM-2培養(yǎng)液誘導BMSCs 7～10d，所得細胞接種于明膠包被的玻片，分別行Ⅷ因子免疫組織化學和豆蔻凝集素直接免疫熒光染色鑒定。 3.細胞增殖試驗按2×103個/孔將BMSCs接種于96孔板培養(yǎng)24h，更換含刺激因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，采用MTT法，酶標儀波長490nm檢測OD值。每次實驗設平行孔4孔，實驗重復3次。 4.細胞趨化試驗按1×105個/孔(1001u1)將細胞加入Transw

3、ell上室，下室加含刺激因素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，細胞刮刮取外膜細胞，放入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)6h，MTT法，酶標儀490nm檢測OD值，以OD值代表細胞遷移率。每次設平行孔2孔，實驗重復3次。 5.細胞劃痕試驗按1×104個/孔將細胞接種于24孔板，90％融合后用10μl槍頭于每孔中央劃一垂直線，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置6h。6h后加刺激因素分別于0、6、16h攝像。ScionImage圖像處理系統(tǒng)處理照片，計算劃痕面積愈合百分比。以創(chuàng)口愈合面

4、積百分比代表細胞平行遷移率。每次設平行孔2孔，實驗重復3次。 6.用羅丹明-鬼筆毒環(huán)肽和異硫氰酸熒光素-紐蛋白免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察高濃度各組和對照組細胞F-actin和Vinculin的改變。用Western blot檢測高濃度各組和對照組細胞ROCKⅠ和：ROCK Ⅱ的表達。 7.實驗分為4組：VEGF組、HA-1077組、VEGF+HA-1077組和對照組，前三組又分低、中、高三個濃度組。VEGF三濃度為1