整合素α4在骨髓間充質干細胞向膠質瘤遷移過程中的作用及其相關機制研究.pdf

1、目的：
　　作為人類中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，膠質瘤由于其侵襲性生長方式，易發(fā)生腦內轉移的特點，即使采用了手術輔以放、化療的綜合治療方案，患者預后仍然不理想。近年來，越來越多的學者對膠質瘤的治療提出了新的方案——靶向性基因治療。靶向性基因治療是在某一載體中導入功能基因，并對腫瘤細胞進行靶向定位，從而定向攻擊腫瘤細胞。目前在靶向性基因治療研究中最受研究者關注的問題之一是如何選擇合適的載體。繼以病毒載體之后，有研究報道可以利用干細

2、胞的趨瘤特性將其作為治療性基因的載體。間充質干細胞(mesenchymalstem cells，MSCs)是一種來源于中胚層的成體干細胞。因MSCs具有組織來源多樣和向膠質瘤定向遷移的特點，使其可能成為膠質瘤靶向治療較為理想的載體。在眾多來源的MSCs中，骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs)因其可自體取材，易于體外擴增等特點而得到越來越多研究者的青睞。Integrinα4作為整合素家族的一個成員，可以在細胞遷移過程中發(fā)揮重要的作用，并且

3、已被證實參與調控白細胞等免疫細胞跨內皮遷移。
　　本研究中我們首先建立大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)體系并對所獲得細胞的表面標志物和多向分化能力進行鑒定;其次利用傷痕愈合實驗和Transwell體外遷移模型來研究BMSCs向膠質瘤細胞定向遷移以及integrinα4在這一過程中的作用;并進一步運用聚合酶鏈式反應(PCR)、免疫熒光、蛋白免疫印跡(westernblot)技術研究膠質瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs表達integrinα4的影

4、響;最后利用PI3K，NF-κB，MEK，p38MAPK和JNK信號通路的特異性抑制劑探討調控膠質瘤誘導BMSCs對integrinα4表達變化以及BMSCs定向遷移過程中所可能涉及的相關信號轉導機制。
　　實驗材料和方法：
　　一、實驗材料
　　1、主要試劑:
　　DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，兔抗大鼠CD34、CD45、CD73、CD90、CDl05多克隆抗體（北京博奧森），int

5、egrinα4單克隆抗體(Abcam)，75cm2培養(yǎng)瓶和Transwell小室(Corning)。SB203850(Enzo)，LY294002(CellSignalingTechnology),SP600125(Enzo), PD98059(Enzo)及BAY11-7082(Enzo),TRizol(Life technologies), RNA PCR Kit(AMV) ver3.0(TaKaRa), SYBR PremixEx

6、TaqTMII Kit(TaKaRa)。羅丹明標記的山羊抗兔熒光二抗（北京博奧森），RIPA裂解液(Sigma)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆一抗(Santa Cruz)，山羊抗小鼠HRP二抗(Santa Cruz)。Transwell小室(聚碳酸酯膜，孔徑為8μm，型號3422，ComingCostar)。ECL化學發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific)。
　　2、實驗動物
　　BMSCs培養(yǎng)原代取材使用4-6周齡

7、健康雌性SD大鼠，體重60-80g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。
　　3、主要儀器
　　細胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;倒置顯微鏡（日本TMS公司）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）;FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）;超聲粉碎機（德國Hielscher公司）;臺式低溫超速離心機（美國Sigma公司）;

8、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;轉印儀（北京市六一儀器廠）;Las3000成像系統(tǒng)（日本Fujifilm公司）;凝膠成像分析軟件（江蘇捷達科技有限公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）;恒溫震蕩水?。ü枮I市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）。
　　二、實驗方法
　　1、全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs。
　　2、流式細胞術

9、鑒定BMSCs細胞表面標記物。
　　3、鑒定原代培養(yǎng)獲得的BMSCs具有向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分化的能力。
　　4、利用Transwell小室建立體外遷移模型評價BMSCs向膠質瘤的定向遷移。
　　5、傷痕愈合實驗評價膠質瘤條件培養(yǎng)基孵育對BMSCs遷移能力的影響。
　　6、RT-PCR和免疫熒光法評估integrinα4在BMSCs的表達。
　　7、MTS檢測膠質瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs增殖的影響

10、。
　　8、膠質瘤條件培養(yǎng)基孵育BMSCs24小時后，利用RT-PCR、免疫熒光及western blot檢測integrinα4表達的改變。
　　9、流式細胞術檢測膠質瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs細胞周期的影響。
　　10、體外遷移模型評估integrinα4在BMSCs向膠質瘤遷移過程中的作用。
　　11、膠質瘤條件培養(yǎng)基孵育同時分別加入SB203850（10μM），LY294002（30μM），SP600125

11、（10μM），PD98059（10μM）及BAY11-7082（5μM），RT-PCR及western blot測定上述抑制劑對膠質瘤條件培養(yǎng)基誘導BMSCs表達integrinα4變化的影響。
　　12、膠質瘤條件培養(yǎng)基孵育同時加入BAY11-7082（5μM），利用Transwell體外遷移模型和傷痕愈合實驗模型評估BAY11-7082對BMSCs向膠質瘤遷移能力的影響。
　　13、數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件。所有

12、實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用One-way ANOVA檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　一、大鼠BMSCs的分離鑒定
　　1、原代培養(yǎng)骨髓細胞4天后，鏡下可見貼壁細胞;P1，P2，P3代細胞可見細胞呈長梭形，旋渦狀生長。
　　2、經流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)所獲得的P3代BMSCs CD34(陽性率1％)，CD45（陽性率0.966％）表達呈陰性，同時CD73（陽

13、性率98.7％），CD90（陽性率99.1％），CD105（陽性率98.3％）表達呈陽性。
　　3、用P3代BMSCs進行成骨，成脂，成軟骨三系分化實驗。誘導分化后的BMSCs分別對礦結節(jié)染色、脂肪油滴染色和膠原蛋白染色呈陽性表達，證實所獲得的BMSCs具有向成骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞分化的能力。
　　二、阻斷integrinα4抑制BMSCs向膠質瘤的定向遷移
　　1、傷痕愈合實驗結果顯示在膠質瘤條件培養(yǎng)基孵育下B

14、MSCs遷移能力明顯增強。
　　2、Transweil體外遷移模型中，在下室內加入膠質瘤條件培養(yǎng)孵育，BMSCs可以發(fā)生定向遷移，證實BMSCs具有向膠質瘤定向遷移的能力。
　　3、Integrinα4單克隆阻斷抗體明顯抑制了BMSCs向膠質瘤的定向遷移。
　　三、膠質瘤條件培養(yǎng)基上調BMSCs對integrinα4的表達
　　1、RT-PCR證實膠質瘤條件培養(yǎng)基促進BMSCs對integrinα4 mRNA的表

15、達
　　2、免疫熒光實驗結果顯示膠質瘤條件培養(yǎng)基可以上調BMSCs對integrinα4的表達。
　　3、Western blot證實膠質瘤條件培養(yǎng)基明顯增加了BMSCs對integrinα4的表達
　　四、NF-κB，PI3K通路參與由膠質瘤條件培養(yǎng)基誘導的BMSCs對integrinα4上調表達過程的調控
　　1、NF-κB和PI3K通路抑制劑可以明顯抑制膠質瘤條件培養(yǎng)基誘導BMSCs對integrinα4的

16、上調表達。
　　2、JNK、p38MAPK、MEK通路抑制劑對膠質瘤誘導的integrinα4上調表達無明顯抑制作用。
　　五、NF-κB是調控BMSCs向膠質瘤定向遷移的相關信號分子
　　傷痕愈合實驗、Transwell遷移模型實驗結果提示NF-κB通路抑制劑BAY11-7082可以明顯減弱BMSCs向膠質瘤的遷移。
　　結論：
　　1、Integrinα4參與了BMSCs向膠質瘤定向遷移過程的調控，膠質