鹽酸法舒地爾促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與Rho分子信號通路的阻斷劑鹽酸法舒地爾(HA1077)對全層皮膚缺損的修復(fù)作用。 方法: (1)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)、鑒定和向表皮細(xì)胞分化趨向的實(shí)驗(yàn)研究:抽取健康新西蘭大耳白兔骨髓，采用直接貼壁法(全骨髓培養(yǎng)法)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，48h后首次更換培養(yǎng)基，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔2-3天換液1次，接近融和時(shí)按1:2或1:3比例傳代培養(yǎng)，留取第3-5代備用；采用免疫組織化學(xué)

2、和流式細(xì)胞儀對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增培養(yǎng)3代后以70％完全培養(yǎng)基+30％成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基上清液+10ng/LEGF誘導(dǎo)分化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并于誘導(dǎo)后7d運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測CK19、β1的表達(dá)。 (2)HA1077與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同應(yīng)用修復(fù)全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究 ①將18只Wistar大鼠背部左右兩側(cè)各置備一直徑為2cm的圓形皮膚缺損，缺損深至皮下。隨機(jī)分為六組每三只動(dòng)物為一組，將5種不同劑量

3、的HA1077(每個(gè)創(chuàng)面0.5ml)應(yīng)用于皮膚缺損創(chuàng)面并設(shè)立一空白對照組，治療后以創(chuàng)面面積的變化及組織學(xué)改變評價(jià)愈合質(zhì)量。 ②取新西蘭大耳白兔12只，隨機(jī)分為六組:空白對照組(A組)、EGF對照組(B組)、MSCs治療組(C組)、誘導(dǎo)細(xì)胞治療組(D組)、MSCs+HA1077治療組(E組)和誘導(dǎo)細(xì)胞+HA1077治療組(F組)。 在背部脊柱兩側(cè)1cm處由前至后制備6個(gè)直徑為3cm的圓形皮膚缺損(每側(cè)各3個(gè))，深至皮下。創(chuàng)

4、面按分組要求注射藥品和細(xì)胞創(chuàng)面按分組要求注射藥品：MSCs及誘導(dǎo)細(xì)胞(誘導(dǎo)細(xì)胞為經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化7天后所收集的細(xì)胞)濃度均為2×106/ml，每個(gè)創(chuàng)面注射細(xì)胞懸液1ml；HA1077濃度根據(jù)前一實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定，每一創(chuàng)面注射0.5ml。細(xì)胞懸液及藥品均直接注射至受試動(dòng)物創(chuàng)面組織內(nèi)。于傷后第3、7、14d用透明膜覆蓋創(chuàng)面，并計(jì)算創(chuàng)面愈合指數(shù)，計(jì)算各組平均愈合時(shí)間。傷后3、7、14、21d按分組隨機(jī)選擇動(dòng)物創(chuàng)面取創(chuàng)面組織行常規(guī)組織學(xué)(HE

5、染色)檢查。統(tǒng)計(jì)分析：本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。 結(jié)果： (1)全骨髓培養(yǎng)48h后可見部分散在圓形貼壁細(xì)胞，5d左右可見細(xì)胞集落，10d后形成集落的數(shù)目、大小明顯增加，細(xì)胞逐漸融合成片，培養(yǎng)至14d左右時(shí)細(xì)胞融合達(dá)80％-90％。傳代后4h多數(shù)細(xì)胞貼壁變形，生長迅速，約7d左右達(dá)完全融合，即可繼續(xù)傳代。細(xì)胞化學(xué)檢測本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的細(xì)胞CD34(-)、C

6、D44(+)、CD105(+)，可以證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為較純的MSCs，流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果。MSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)7d后可見細(xì)胞由原來的長梭形成纖維細(xì)胞狀結(jié)構(gòu)逐漸變短，細(xì)胞緊密排列成片，并可表達(dá)CK19、β1等標(biāo)志。 (2)①大鼠各組創(chuàng)面面積隨傷后時(shí)間延長而逐漸縮小，其中以應(yīng)用20μmol/LHA1077組創(chuàng)面縮小更為明顯。 ②C、D、E、F四組在各檢測時(shí)間點(diǎn)愈合指數(shù)均明顯大于A、B兩組，其中E組、F組愈合指數(shù)

7、又明顯大于其它兩治療組。E組和F組的平均愈合時(shí)間分別為17.25±1.29天和17.67±1.25也明顯快于其他組別，并且在皮膚愈合的病理結(jié)構(gòu)上該兩組也明顯優(yōu)于其他各組。但C組與D組之間、E組與F組之間無論愈合指數(shù)還是平均愈合時(shí)間均無顯著性差異。 結(jié)論： (1)應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法，可以分離、純化培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所培養(yǎng)的。MSCs體外生長穩(wěn)定、增殖速度快、可連續(xù)傳代，可用于MSCs功能及應(yīng)用的進(jìn)一步研究。 (2