OGP對奶牛成骨細胞、骨髓基質(zhì)干細胞的作用及其微囊化研究.pdf

1、成骨生長肽（Osteogenic growth peptide，OGP）是一種高效促成骨及造血刺激因子。普遍存在于哺乳動物的血液中，對促進骨形成、松質(zhì)骨密度及骨折的愈合具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)，OGP通過自分泌及旁分泌途徑，促進人及嚙齒目動物的成骨細胞及骨髓基質(zhì)干細胞分化、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性及基質(zhì)礦化。本試驗從以下五個方面探討了OGP對奶牛骨髓基質(zhì)干細胞及成骨細胞作用及調(diào)控機制，并對OG

2、P轉(zhuǎn)基因細胞微囊生物學(xué)特性進行研究。
　　 1.奶牛骨鈣素抗體制備
　　 以奶牛骨組織提取的RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴增出奶牛骨鈣素（Bone calcium protein，BGP）全長cDNA，然后將擴增產(chǎn)物重組到PMD-18T載體中，測定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨鈣素全長cDNA為303bp，編碼100個氨基酸，與GenBank中的X53699的序列完全相同。通過重疊延伸PCR技術(shù)連接單鏈

3、DNA片段人工定點同義突變，將奶牛骨鈣素成熟蛋白基因中的大腸桿菌稀有密碼子同義突變成大腸桿菌常用密碼子并亞克隆到PET-32a表達載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，成功表達出奶牛骨鈣素融合蛋白，并成功制備奶牛骨鈣素多抗血清，為后續(xù)試驗提供了抗體。
　　 2.OGP對奶牛骨髓基質(zhì)干細胞增殖、分化及礦化的影響及其調(diào)控機制研究
　　 本試驗研究了OGP對奶牛體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞增殖及分化特性的作用。結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn)，成骨生長肽能促進奶牛骨髓基質(zhì)干細胞的增殖，并能促進奶牛骨髓基質(zhì)干細胞ALP活性及礦化的形成，另外能刺激BGP mRNA的表達。OGP能刺激奶牛骨髓基質(zhì)干細胞內(nèi)皮一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthases，eNOS）的表達，當(dāng)eNOS表達受到抑制時，OGP對奶牛骨髓基質(zhì)干細胞的促分化活性受到抑制。由此認為，OGP能刺激奶牛骨髓基質(zhì)干細胞的增殖及向成骨細胞分化，并且是通過eNOS介導(dǎo)。

5、>　　 3.OGP對奶牛成骨細胞增殖、分化及礦化的影響及其調(diào)控機制研究
　　 本試驗研究了外源性O(shè)GP對體外培養(yǎng)的奶牛成骨細胞增殖、分化及礦化的影響。組織塊移行法分離奶牛成骨細胞，通過形態(tài)觀察及堿性磷酸酶活性鑒定。MTT法檢測不同濃度OGP對成骨細胞生長的作用。細胞質(zhì)堿性磷酸酶活性及骨鈣素水平分別通過比色法檢測及放射免疫法測定。硒素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)。結(jié)果顯示，成骨生長肽能明顯促進奶牛成骨細胞的增殖，最大效應(yīng)濃度為10-9M；

6、并且能促進成骨細胞ALP活性、骨鈣素及礦化結(jié)節(jié)的形成；當(dāng)抑制osterix基因表達，成骨生長肽促進奶牛成骨細胞ALP活性及骨鈣素分泌相應(yīng)受到抑制。由此揭示，OGP對奶牛成骨細胞增殖及分化具有促進，并且是通過上調(diào)osterix介導(dǎo)。
　　 4.體內(nèi)氧自由基對移植細胞微囊活性的影響
　　 為了揭示細胞微囊移植過程中宿主體內(nèi)氧自由基的動態(tài)變化特征。將細胞微囊、空微囊以及生理鹽水在移植小鼠體內(nèi)后1、4、7天，檢測血清自由基，MD

7、A及SOD水平。過氧化氫及MDA水平在空微囊移植后瞬時升高，后又降低到正常水平，但是細胞微囊移植組，移植后持續(xù)升高。NO及SOD水平在空微囊及細胞微囊移植組均升高，但是生理鹽水注射組無明顯變化。細胞微囊在移植7天后回收，通過AO/EB染色發(fā)現(xiàn)，細胞具有良好的活性。由此認為，NO是微囊特異性的刺激形成因子，氧自由基在微囊移植早期迅速升高，但是由于體內(nèi)抗氧化物酶升高從而能有效清除。
　　 5.OGP轉(zhuǎn)基因細胞微囊體內(nèi)及體外增殖及分泌

8、特性
　　 研究為OGP轉(zhuǎn)基因細胞微囊在體內(nèi)及體外的增殖及分泌特征。本試驗檢測了OGP轉(zhuǎn)基因細胞微囊在體外培養(yǎng)條件下的增殖及OGP分泌活性，并將微囊細胞移植入骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)，檢測微囊內(nèi)細胞增殖及OGP分泌活性，并對骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)氧自由基及抗氧化物酶的活性進行了檢測。結(jié)果顯示，OGP轉(zhuǎn)基因細胞微囊在體外培養(yǎng)條件下具有良好的增殖及分泌活性，而在骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)細胞大量死亡，宿主動物血清OGP含量無明顯變化。骨質(zhì)疏松模