ROCK抑制劑法舒地爾對脂多糖致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌性膿毒癥及其伴隨的嚴(yán)重的并發(fā)癥是臨床常見的、威脅生命的疾病。而所有這些并發(fā)癥的一個共同點就是內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)是肺組織的重要實質(zhì)細(xì)胞，在肺損傷過程中既是首位受損傷的靶細(xì)胞，又是活躍的炎癥細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，深入探討PMVECs損傷機(jī)制在肺循環(huán)疾病的研究中至關(guān)重要。
　　感染尤其是革蘭氏陰性菌膿毒癥是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)等肺循環(huán)疾病

2、的主要病因。細(xì)菌脂多糖(LPS)作為革蘭陰性桿菌外膜上的一種糖蛋白，在體內(nèi)可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，直接或間接損傷PMVECs，在感染性ALI/ARDS的病理過程中起關(guān)鍵作用。炎性刺激下PMVECs損傷的調(diào)控機(jī)制涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在ALI/ARDS、肺動脈高壓、肺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中均有RhoA/Rho激酶（ROCK）信號通路的參與。RhoA/ROCK通路作為體內(nèi)普遍存在的一條信號通路，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著信號轉(zhuǎn)換器或

3、分子開關(guān)的作用，能夠誘發(fā)肌動蛋白細(xì)胞骨架重排、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期進(jìn)程等。然而，RhoA/ ROCK通路在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷中的調(diào)節(jié)機(jī)制以及與其他信號通路的交叉反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。因此，本實驗以LPS誘導(dǎo)大鼠PMVECs損傷為模型，觀察RhoA/ROCK通路在PMVECs損傷中的變化。并通過細(xì)胞免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦及細(xì)胞分子生物學(xué)等技術(shù)研究ROCK抑制劑法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷的影響，深入探

4、討其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　第一部分 RhoA/ROCK通路參與LPS誘導(dǎo)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷
　　目的:研究RhoA/ROCK通路在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷中的變化及可能機(jī)制。
　　方法:組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠PMVECs，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色及透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)鑒定大鼠PMVECs; MTT及乳酸脫氫酶(LDH)法測定PMVECs細(xì)胞活力;RT-PCR檢測RhoA、ROCK1mRNA的

5、表達(dá);Western blot檢測MYPT1磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1 PMVECs體外培養(yǎng)及鑒定
　　采用組織貼塊法并加以改良成功培養(yǎng)出大鼠PMVECs，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，基本形成細(xì)胞單層，匯合呈典型的鋪路鵝卵石狀排列。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明，約95％的細(xì)胞表現(xiàn)為陽性。電鏡結(jié)果表明:多數(shù)細(xì)胞均可觀察到質(zhì)膜突起，即微絨毛;在細(xì)胞漿中還觀察到W-P小體;另外有大量的質(zhì)膜小泡（又稱吞飲小泡）存

6、在于細(xì)胞漿內(nèi)，上述結(jié)構(gòu)符合典型的內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征。結(jié)合我們的取材部位為肺外邊緣組織，因此可以證實分離培養(yǎng)的細(xì)胞的確為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2 LPS對大鼠PMVECs細(xì)胞生長的影響及法舒地爾的干預(yù)作用
　　MTT實驗結(jié)果表明:與對照組（OD值為0.95±0.12）相比，0.01、0.1、1μg/ml LPS對大鼠PMVECs生長沒有明顯影響;而10、100μg/ml LPS處理組OD值分別降為0.75±0.19(P＜0

7、.05)和0.50±0.12(P＜0.01)，細(xì)胞生長明顯抑制。10μg/ml LPS能明顯造成PMVECs損傷，但又不至于導(dǎo)致?lián)p傷過重，仍留有足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，因此，初步選定用10μg/ml LPS制作PMVECs損傷模型。10μg/ml LPS作用6h和12h時對細(xì)胞生長沒有明顯影響，作用24 h時OD值為0.73±0.19，與LPS作用0h（OD值為0.93±0.15）相比，PMVECs生長明顯受到抑制(P＜0.05)，

8、在48 h和72 h時，仍處于較低水平。25，50μM法舒地爾預(yù)處理對LPS作用24 h導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有不同程度的改善（與LPS組相比，P＜0.05）。
　　3 LPS對大鼠PMVECsLDH活性的影響及法舒地爾的干預(yù)作用
　　對照組上清液中LDH活性為127.6±17.3 U/L，0.1、1、10、100μg/mlLPS作用24 h均不同程度地引起LDH的活性升高，分別升至155.1±23.4U/L(P＜0.05)、162

9、.3±34.3 U/L(P＜0.05)、189.1±25.1 U/L(P＜0.01)及194.7±22.7 U/L(P＜0.01)。10μg/ml LPS作用6h時LDH活性明顯升至139.7±19.2 U/L，與LPS作用0h（LDH活性114.1±21.1 U/L）相比差異顯著(P＜0.05)，隨著作用時間延長，LDH活性持續(xù)增高，說明PMVECs受損越來越嚴(yán)重。不同濃度（10，25，50μM）法舒地爾預(yù)處理組上清液中LDH活性均有

10、不同程度地下降(P＜0.05或P＜0.01)，進(jìn)一步說明法舒地爾在一定程度上減少了LDH的釋放，改善了LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷。
　　4 LPS誘導(dǎo)的PMVECs損傷中RhoA、ROCK1 mRNA表達(dá)的變化
　　與對照組(LPS0 min)相比，10μg/ml LPS作用15 min即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中RhoA mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，作用5 min即明顯誘導(dǎo)ROCK1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05

11、)。隨著作用時間的延長，RhoA、ROCK1 mRNA的表達(dá)逐漸升高，RhoA mRNA的表達(dá)在LPS作用60 min時達(dá)到最高(P＜0.01)，ROCK1mRNA的表達(dá)在LPS作用15 min和60 min時出現(xiàn)兩次表達(dá)高峰(P＜0.01)。隨后，RhoA、ROCK1 mRNA的表達(dá)雖有所下降，但直到240 min仍顯著高于對照組(LPS0 min)(P＜0.O1)。表明RhoA/ROCK信號通路可能參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs

12、損傷。
　　5 LPS對PMVECs中MYPT1磷酸化水平的影響及法舒地爾的干預(yù)作用
　　ROCK活化后，進(jìn)一步磷酸化其下游底物MYPT1，因此，MYPT1磷酸化水平的高低反映了ROCK的活化程度。Western blot結(jié)果顯示，10μg/ml LPS在作用5 min即明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs中p-MYPT1的表達(dá)（P＜0.05），且在15 min時MYPT1磷酸化水平達(dá)到最高(P＜0.01)。隨后，p-MYPT1的表達(dá)

13、雖有不同程度地下降，但直到120 min仍顯著高于對照組(LPS0 min)(P＜0.01)。法舒地爾10、25、50μM預(yù)處理不同程度地降低LPS作用15 min誘導(dǎo)的p-MYPT1的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:本實驗成功分離和培養(yǎng)了原代大鼠PMVECs。LPS明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs損傷，RhoA/ROCK信號通路參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs損傷。
　　第二部分法舒地爾對LPS致大鼠PMVEC

14、s凋亡、骨架重排的影響及機(jī)制研究
　　目的:探討ROCK抑制劑法舒地爾對LPS致大鼠PMVECs凋亡及骨架重排的影響及作用機(jī)制。
　　方法:AnnexinV/PI及Hoechst33258熒光染色法檢測大鼠PMVECs凋亡;F-actin免疫熒光染色觀察PMVECs骨架結(jié)構(gòu)的改變;Western blot檢測ERK1/2、JNK1/2/3、p38的磷酸化水平以及Bax、Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:

15、　　1法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡的影響
　　1.1 LPS作用不同時間對大鼠PMVECs凋亡的影響
　　結(jié)果顯示:10μg/ml LPS作用6h對凋亡沒有明顯影響。與對照組(LPS0h，早期和晚期凋亡率分別為3.1±0.7％和1.0±0.3％)相比，LPS作用12、24、48、72 h各時間點的早期凋亡率分別增至15.1±3.8％(P＜0.01)，24.3±3.6％(P＜0.01)，34.8±4.5％(P＜0

16、.01)和43.2±8.2％（P＜0.01）。晚期凋亡率分別增至2.1±0.9％(P＜0.05)，9.6±2.1％（P＜0.01），12.2±4.7％（P＜0.01），29.1±7.4％(P＜0.01)，均有不同程度的增加，說明LPS明顯誘導(dǎo)了大鼠PMVECs凋亡。
　　1.2法舒地爾明顯降低了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡
　　與對照組（早期和晚期凋亡率分別為2.1±0.7％和3.0±0.7％）相比，LPS作用24 h早

17、期和晚期凋亡率分別增至37.8±8.1％(P＜0.01)和10.7±2.6％(P＜0.01)。10，25和50μM法舒地爾預(yù)處理明顯降低了LPS誘導(dǎo)的PMVECs凋亡，早期凋亡率分別降至27.7±4.6％(P＜0.05)，21.8±5.9％(P＜0.01)和18.6±3.9％(P＜0.01);而晚期凋亡率分別降至7.5±1.3％(P＜0.05)，6.4±1.3％(P＜0.05)和5.3±1.4％（P＜0.01），與LPS組相比差異顯著，

18、說明法舒地爾明顯干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。
　　1.3法舒地爾改善了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡形態(tài)的改變
　　采用Hoechst33258染色觀察了PMVECs凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果可見，正常對照組細(xì)胞核呈較規(guī)整的圓形或橢圓形，邊緣整齊，呈彌漫均勻的低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，無明顯的調(diào)亡細(xì)胞;10μg/ml LPS處理24 h后，細(xì)胞核致密濃染，核固縮，呈月牙形，并呈高亮度熒光，部分核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，表明L

19、PS明顯誘導(dǎo)了PMVECs凋亡。10，25和50μM法舒地爾干預(yù)后核濃染、固縮等具有明顯凋亡形態(tài)的細(xì)胞與LPS組相比均有不同程度的減少，進(jìn)一步說明法舒地爾能明顯干預(yù)LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。
　　1.4法舒地爾對凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bel-2表達(dá)的影響
　　與對照組相比，10μg/ml LPS作用24 h明顯上調(diào)了Bax的蛋白表達(dá)(P＜0.01)，同時也顯著降低了Bcl-2的蛋白表達(dá)(P＜0.01)。而不同濃度(10

20、，25，50μM)的法舒地爾預(yù)處理明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的Bax和Bcl-2的表達(dá)失衡情況，不同程度的抑制了Bax的表達(dá)，升高了Bcl-2的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)，表明法舒地爾可能通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。
　　2法舒地爾對PMVECs骨架蛋白F-actin分布的影響
　　正常對照組可見少量的肌動蛋白纖維絲，主要分布在細(xì)胞周邊，且線條完整連續(xù)。10μg/ml LPS處

21、理后，胞漿F-actin纖維絲明顯增多，大多沿細(xì)胞呈縱軸排列。細(xì)胞周邊的F-actin逐漸斷裂消失，胞漿中出現(xiàn)密集的束狀應(yīng)力纖維。且隨著LPS作用時間的延長，F(xiàn)-actin在細(xì)胞內(nèi)雜亂無章、彌散分布，甚至細(xì)胞間失去正常連接結(jié)構(gòu)。而在預(yù)處理了ROCK抑制劑法舒地爾（10，25，50μM）的細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)的PMVECs應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞骨架形態(tài)改變的現(xiàn)象均被不同程度地抑制，F(xiàn)-actin表達(dá)及熒光強(qiáng)度也明顯減弱，說明法舒地爾能明顯抑制L

22、PS誘導(dǎo)的PMVECs骨架結(jié)構(gòu)的改變。
　　3法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs中MAPKs活化的影響
　　LPS（10μg/ml）在作用15 min時即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中ERK1/2磷酸化水平明顯升高，且在60 min時ERK1/2磷酸化水平達(dá)到最高。相同實驗條件下，預(yù)先加入不同濃度的法舒地爾預(yù)處理，并沒有改變LPS誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平的升高，說明在LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡中ERK1/2并不

23、是RhoA/ROCK的下游信號。另外，從JNK1/2/3及p38 MAPKs的活化程度來看，LPS（10μg/ml）在作用5 min時即開始明顯誘導(dǎo)大鼠PMVECs中JNK1/2/3及p38磷酸化水平增高，且在30 min時二者的磷酸化水平均達(dá)到最高。相同實驗條件下，預(yù)先加入不同濃度（10，25，50μM）的法舒地爾預(yù)處理，均不同程度地抑制了LPS作用30 min誘導(dǎo)的JNK1/2/3及p38磷酸化水平的增高(P＜0.05或P＜0.01

24、)。說明JNK1/2/3及p38可能作為RhoA/ROCK的下游信號分子參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。
　　4 JNK和p38 MAPKs的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡
　　為進(jìn)一步闡明JNK和p38的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。我們在接下來的實驗中觀察了SB203580(p38抑制劑)以及SP600125（JNK抑制劑）對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。SB

25、203580(10μM)、SP600125(20μM)預(yù)處理分別明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的p38和JNK1/2/3磷酸化水平的增高(P＜0.01)，說明SP600125和SB203580能分別起到抑制JNK1/2/3和p38 MAPKs活化的作用。凋亡檢測結(jié)果表明，SB203580和SP600125預(yù)處理明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的PMVECs凋亡，早期和晚期凋亡率有不同程度下降(P＜0.05或P＜0.01)。同時，SB203580及SP6001

26、25預(yù)處理還明顯逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)失衡情況，抑制了Bax的表達(dá)，升高了Bcl-2的表達(dá)(P＜0.01)，進(jìn)一步說明JNK和p38的活化參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。
　　結(jié)論:JNK1/2/3和p38 MAPKs作為ROCK的下游信號分子參與了LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs凋亡。法舒地爾作為唯一在臨床應(yīng)用的ROCK抑制劑，明顯干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的凋亡、骨架蛋白重排等細(xì)胞損傷，這一保護(hù)作用與

27、其抑制ROCK通路及其下游JNK1/2/3和p38 MAPKs信號分子活化有關(guān)。
　　第三部分法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs炎性因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究
　　目的:研究法舒地爾對LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs炎性因子表達(dá)的影響，并從氧化損傷角度出發(fā)探討其作用機(jī)制。
　　方法:RT-PCR檢測IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA的表達(dá);ELISA法檢測上清液中IL-6和MCP-1的含量;激光共聚焦檢測PMVE

28、Cs中ROS的產(chǎn)生;試劑盒測定PMVECs中SOD、GSH-PX活力及MDA含量;Westernblot法測定PMVECs全蛋白及核蛋白中NF-κBp65的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1法舒地爾對PMVECs中IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA表達(dá)的影響
　　與對照組(LPS0h)相比，10μg/ml LPS在作用3h時IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)即開始明顯升高(P＜0.01)，6h時MCP-1 mRNA表達(dá)

29、水平達(dá)到最高，12 h時IL-6 mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，一直到48h，IL-6和MCP-1 mRNA仍處于高表達(dá)水平(P＜0.01)。10、25、50μM的法舒地爾預(yù)處理，均明顯抑制了LPS作用12h誘導(dǎo)的IL-6 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，也不同程度地抑制了LPS作用6h誘導(dǎo)的MCP-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。然而，LPS對TNF-α mRNA的表達(dá)沒有明顯影響。
　　2法舒地爾對LPS誘導(dǎo)大鼠

30、PMVECs分泌IL-6及MCP-1的影響
　　與對照組(LPS0 h，IL-6和MCP-1的分泌量分別為475±76 pg/ml、1.082±0.389μg/ml)相比，LPS在作用3h時IL-6蛋白分泌量即開始明顯升高(P＜0.05)，12h時分泌量達(dá)最高（1098±81 pg/ml，P＜0.01），一直到48 h仍處于較高水平(P＜0.01)。而MCP-1分泌量在LPS作用3、6、12h分別升至1.988±0.017μg/m

31、l(P＜0.05)、2.026±0.066μg/ml(P＜0.05)、2.038±0.072μg/ml(P＜0.05)。而且，LPS處理不同時間組與相應(yīng)各時間點的對照組相比，IL-6和MCP-1蛋白分泌量均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。10、25、50μM的法舒地爾預(yù)處理，均不同程度地降低了LPS作用不同時間點誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1的蛋白分泌水平(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3 LPS誘導(dǎo)的大鼠PMVECs中

32、ROS的生成及法舒地爾對此的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，10μg/ml的LPS作用從3h到48 h，熒光強(qiáng)度均不同程度地增強(qiáng)(P＜0.01)，表明細(xì)胞內(nèi)活性氧生成量明顯升高，其中LPS處理6h時熒光強(qiáng)度達(dá)最高水平，12h時仍維持在接近于最高水平，隨后各時間點(LPS處理24 h和48 h)熒光強(qiáng)度有所減弱，但仍明顯高于對照組(P＜0.01)。與LPS作用6h組相比，10，25，50μM的法舒地爾預(yù)處理組，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度

33、均明顯降低(P＜0.01)，說明法舒地爾明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的PMVECs內(nèi)ROS的生成。
　　4法舒地爾對PMVECs中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，10μg/ml LPS作用3、6、12、24、48 h各時間點組，SOD活性均表現(xiàn)出不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中，LPS作用12h組SOD活性降至最低。而GSH-PX活性在LPS作用6h時即開始有所下降(P

34、＜0.05)，LPS作用12、24和48 h時GSH-PX活性均處于較低水平(P＜0.01)。相反，MDA的含量隨著LPS作用時間的延長明顯升高，在LPS作用6h時即開始明顯升高(P＜0.01)，12h時達(dá)最高值，一直到48h，仍處于較高水平。而10，25，50μM法舒地爾預(yù)處理均不同程度地逆轉(zhuǎn)了LPS作用12 h誘導(dǎo)的PMVECs中SOD和GSH-PX活性的降低(P＜0.05或P＜0.01);同時也不同程度地降低了MDA的含量(P＜0

35、.05或P＜0.01)。
　　5法舒地爾對LPS作用下大鼠PMVECs中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　與對照組(LPS0 h)相比，在LPS作用不同時間點，全蛋白中NF-κB p65的蛋白表達(dá)沒有明顯變化。而PMVECs細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平在LPS作用3h即明顯升高(P＜0.01)，12h時表達(dá)水平最高，直到48 h仍有較高的表達(dá)水平(P＜0.01)。10，25，50μM法舒地爾預(yù)處理均明顯降低了細(xì)

36、胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達(dá)(P＜0.01)，推測法舒地爾可能通過抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位從而降低了LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)。
　　6 N-acetylcysteine對LPS作用下大鼠PMVECs中IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)及NF-kB p65核轉(zhuǎn)位的影響
　　5、10 mM N-acetylcysteine均不同程度地降低了LPS作用12h誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)NF-kB p65的蛋白表達(dá)(P＜0.05或P＜

37、0.01)，對LPS誘導(dǎo)的NF-kBp65核轉(zhuǎn)位有一定的抑制作用。同時，5、10 mM N-acetylcysteine還明顯降低了LPS誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:(1) LPS作用下大鼠PMVECs中ROS的生成增多，炎性因子IL-6和MCP-1的表達(dá)升高。ROS抑制劑N-acetylcysteine明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位以及炎性因子的表達(dá)，表明ROS信