腺苷受體A1在間歇低氧細(xì)胞損害中的作用.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopneasyndrome，OSAHS)是兒童常見的一種睡眠紊亂，其主要病理生理機(jī)制為慢性間歇性低氧，常引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，其中最為嚴(yán)重的是兒童學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能方面的障礙，這對(duì)家庭及社會(huì)造成了巨大的影響?，F(xiàn)已明確認(rèn)知功能障礙是OSAHS疾病引起了神經(jīng)元細(xì)胞損傷引起的，但是引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不明確。腺苷受體A1(adenosi

2、ne A1 receptor，ADORA1)存在于多個(gè)系統(tǒng)，以神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)水平最高，已有較多研究提出其在加重細(xì)胞損傷的過程中起到重要的作用。本研究利用間歇低氧PC12細(xì)胞模型、ADORA1激動(dòng)劑、ADORA1抑制劑及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK)、Western Blot法、qRT-PCR法、免疫熒光法檢測(cè)間歇性低氧處理后PC12細(xì)胞存活

3、率的改變及PKC蛋白、磺脲類受體亞基1(sultfonylurea receptor1，SUR1)及內(nèi)向整流鉀通道亞基6.2(inwardlyrectifying potassium channel6.2，Kir6.2)mRNA和蛋白的表達(dá)，闡明ADORA1在間歇低氧致細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法：
　　PC12細(xì)胞傳代后隨機(jī)分為以下幾組:對(duì)照組(Control)、空氣模擬對(duì)照組(air control，AC)、持續(xù)低氧組(

4、sustained hypoxia，SH)、間歇低氧組(intermittent hypoxia， IH)、間歇低氧溶劑(二甲基亞砜，dimethylsulfoxide solution，DMSO)對(duì)照組(DMSO)、間歇低氧ADORA1激動(dòng)劑(2-氯環(huán)戊腺苷，2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine，CCPA)組(CCPA)、間歇低氧ADORA1抑制劑(1，3-二丙基-環(huán)戊黃嘌呤，8-Cyclopentyl-1

5、，3-dipropylxanthine，DPCPX)組(DPCPX)、間歇低氧PKC抑制劑(白屈菜紅堿，Chelerythrine chloride，CHE)組(CHE)。間歇低氧細(xì)胞實(shí)驗(yàn)艙由電腦自動(dòng)控制通入高純度的O2和N2，5％O260min-20％O230min為一個(gè)循環(huán)，共6個(gè)循環(huán)，同時(shí)維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃。持續(xù)低氧細(xì)胞實(shí)驗(yàn)艙通入高純度的O2和N2，5％O2，共6h，維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃?？諝?/p>

6、模擬對(duì)照艙中，輸入正常的空氣，也維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃。實(shí)驗(yàn)造模結(jié)束后，用CCK-8法測(cè)各組細(xì)胞活力變化，Western Blot法檢測(cè)PKC蛋白的表達(dá)，qRT-PCR法測(cè)SUR1、Kir6.2 mRNA的表達(dá)，免疫熒光法測(cè)SUR1、Kir6.2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力變化:八組PC12細(xì)胞存活率之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.11，p＜0.01)。其中，與Control組

7、比較，AC組細(xì)胞存活率無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，SH組及IH組細(xì)胞存活率均較Control組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.01），其中IH組細(xì)胞存活率較SH組下降更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);與IH組比較，DMSO組細(xì)胞存活率無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，CCPA組細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，DPCPX組細(xì)胞存活率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，

8、CHE組細(xì)胞存活率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2、Western Blot法檢測(cè)PKC蛋白表達(dá)量變化:六組PC12細(xì)胞PKC蛋白表達(dá)量之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.98，p＜0.01)。其中，與Control組比較， AC組PKC蛋白表達(dá)量無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，IH組PKC蛋白量表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);與IH組比較，DMSO組PKC蛋白表達(dá)量無明顯改變，差異無統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義(p＞0.05) CCPA組PKC蛋白表達(dá)量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，DPCPX組PKC蛋白表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3、qRT-PCR法測(cè)Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)量變化:七組PC12細(xì)胞Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)量之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.50、73.83，均p＜0.01）。其中，與Control組比較，AC組Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)均

10、無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＞0.05），IH組Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.01）;與IH組比較，DMSO組Kir6.2、SUR1mRNA表達(dá)均無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＞0.05），CCPA組Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.01），DPCPX組Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別p＜0.01及p＜0.

11、05)，CHE組Kir6.2、SUR1 mRNA表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p＜0.01)。
　　4、免疫熒光法測(cè)Kir6.2、SUR1蛋白表達(dá)量表達(dá):七組PC12細(xì)胞Kir6.2、SUR1蛋白表達(dá)量之間存在差異。與Control組比較，AC組Kir6.2、SUR1蛋白表達(dá)均無明顯改變， IH組Kir6.2、SUR1蛋白表達(dá)均上升;與IH組相比，DMSO組Kir6.2、SUR1蛋白表達(dá)均無明顯改變，CCPA組Kir6.2、