eNOS-F92A-Caveolin-1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對野百合堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓大鼠血清IL-6和TNF-α的影響.pdf

1、目的:
　　建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型,采用單獨(dú)表達(dá)eNOS和突變的Caveolin-1（F92A-Caveolin-1）基因，或同時(shí)表達(dá)兩種基因修飾的BMSCs移植入PAH模型，應(yīng)用構(gòu)建慢病毒載體的方法探討eNOS/F92A-Caveolin-1基因修飾BMSCs后對野百合堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管舒張功能、重建肺新生血管及血清IL-6和TNF-α的影響。探討一種新的PAH的細(xì)胞生物治療方法，通過基因突變使所轉(zhuǎn)染的目

2、的基因保持較高活性以增加肺血管舒張因子的分泌，同時(shí)促進(jìn)肺組織的修復(fù)再生。研究成果為未來基于基因修飾的BMSCs治療PAH的研究奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、通過腹腔注射野百合堿60mg/kg，建立野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的PAH大鼠模型。
　　2、采用Ficoll（1.077g/ml）密度梯度離心法從大鼠股骨及脛骨骨髓中提取并培養(yǎng)BMSCs。
　　3、攜帶eNOS/F92A-Caveolin-1基因的慢

3、病毒載體的構(gòu)建、鑒定；將構(gòu)建的慢病毒載體感染 BMSCs。
　　4、進(jìn)行BMSCs移植，觀察對肺小動(dòng)脈中膜厚度、右心肥大指數(shù)及肺血流動(dòng)力學(xué)的影響。
　　5、取大鼠血進(jìn)行血常規(guī)檢測RDW（紅細(xì)胞分布寬度），ELISA法測定血清中IL-6和TNF-α水平。
　　結(jié)果:
　　1、MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH模型的制備：野百合堿呈時(shí)間依賴性增加大鼠的肺動(dòng)脈壓。與正常組相比，PAH組2W mPAP增高（P<0.01）；5W mP

4、AP與2W mPAP相比有顯著性增高（P<0.01）。
　　2、成功分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：原代經(jīng)過三次傳代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定、均一，細(xì)胞呈典型的紡錘樣，魚群樣或螺旋狀貼壁生長。所培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞流式細(xì)胞鑒定：表面抗原標(biāo)志物CD90陽性（92.77±14.36）％，CD44陽性（91.60±1.51）%，CD34陰性（12.5±1.21）%，CD31陰性（8.03±1.15）%。
　　3、帶有GFP標(biāo)記的eNOS/F9

5、2A-Caveolin-1基因感染的BMSCs移植后在熒光顯微鏡下觀察各組慢病毒感染BMSCs的效率達(dá)85%以上。
　　4、與對照組相比，NO的終末穩(wěn)定產(chǎn)物Nitrite的含量以eNOS/F92A-Caveolin-1組最高（P<0.01），同時(shí)發(fā)現(xiàn)作為氮自由基的NO的增高，并不影響各組BMSCs細(xì)胞的活性（P>0.05）。血管形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)eNOS/F92-Cav1組BMSCs的血管形成能力最強(qiáng)。
　　5、野百合堿升高大鼠的

6、肺動(dòng)脈壓力，增大右心肥大指數(shù)，增加肺小動(dòng)脈中膜厚度。
　　6、野百合堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓大鼠炎癥指標(biāo)IL-6和TNF-α平均水平顯著升高，經(jīng)基因治療后IL-6和TNF-α水平與PAH組相比有顯著性降低。IL-6：Ctr（93.30±11.02）VS PAH（140.08±6.27）；PAH（209.34±19.80）VS BMSCs（156.36±2.68）pg/ml；TNF-α：Ctr（951.33±51.46）VS PAH（11

7、48.98±51.56），PAH（1578.65±50.02）VS BMSCs（1421.88±48.35）pg/ml， P均<0.05。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了攜帶目的基因eNOS/F92A-Caveolin-1的重組慢病毒質(zhì)粒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中高效基因轉(zhuǎn)染及探討其生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。
　　2、成功將慢病毒載體介導(dǎo)的eNOS和F92A-caveolin-1基因單獨(dú)或聯(lián)合感染BMSCs。
　　3、各組慢病毒

8、顆粒可高效感染BMSCs，感染效率達(dá)85%以上，其中共感染eNOS和F92A-Caveolin-1慢病毒顆粒的BMSCs組的NO含量最高，但NO含量的增高對BMSCs細(xì)胞活性無明顯殺傷作用，同時(shí)仍具備較強(qiáng)的血管形成能力。
　　4、制備了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型，并將eNOS和F92A-caveolin-1基因感染的BMSCs靜脈注射到PAH模型體內(nèi)。注射后能夠有效地降低MCT誘發(fā)的大鼠肺動(dòng)脈壓，抑制肺血管的重構(gòu)，減輕右心室肥大