野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TRPC-SOCC信號(hào)通路變化.pdf

1、肺高壓（pulmonary hypertension，PH）的顯著特點(diǎn)就是血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈血管平滑肌中Ca2+穩(wěn)態(tài)改變。本研究采用另一種廣泛應(yīng)用的野百合堿（monocrotaline，MCT）誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）大鼠模型，首先觀察TRPC表達(dá)及SOCE變化與PAH的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，進(jìn)而檢測(cè)TRPC通路中相關(guān)信號(hào)分子：基質(zhì)相互作用分子（STIM）、Orai、TRPC、鈣

2、調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）以及激活T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NAFT）的表達(dá)變化，以期研究整個(gè)信號(hào)通路在MCT致PAH大鼠發(fā)病過(guò)程中的作用；并采用環(huán)胞素A（CosA）治療3w，觀察其對(duì)MCT誘發(fā)的大鼠PAH的防治作用，并進(jìn)一步證實(shí)TRPC通路的作用。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TRPC表達(dá)增加及SOCE功能增強(qiáng)
　　目的：

3、研究TRPC/SOCE通路在MCT誘發(fā)PAH發(fā)病過(guò)程中的作用，及其病理生理學(xué)意義。
　　方法：SD大鼠以2％MCT按60 mg/kg劑量一次性腹腔注射，建立MCT誘導(dǎo)的慢性PAH大鼠模型，測(cè)定以下指標(biāo)：①PAH模型鑒定：平均右心室內(nèi)壓、平均右心室收縮壓、右心重量指數(shù)、HE染色觀察肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建；②用real-time RT-PCR方法檢測(cè)肺動(dòng)脈TRPC1-7mRNA表達(dá)，以及上調(diào)的TRPC亞型mRNA表達(dá)時(shí)間曲線，用Western

4、 blot方法檢測(cè)其蛋白表達(dá)；③用離體肺動(dòng)脈環(huán)灌注方法測(cè)定環(huán)匹阿尼酸（CPA）誘導(dǎo)離體肺動(dòng)脈環(huán)（PAs）收縮效應(yīng)及時(shí)間曲線，內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）誘導(dǎo)離體PAs收縮效應(yīng)及不同SOCC阻斷劑的阻斷作用；④CPA及ET-1誘發(fā)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）胞漿游離Ca2+濃度（[Ca2+]i）反應(yīng)；⑤釓離子（Gd3+）和鑭離子（La3+）對(duì)ET-1誘發(fā)的[Ca2+]i變化的阻斷作用。
　　結(jié)果：與正常

5、對(duì)照組（CON組）相比：①M(fèi)CT大鼠的mRVP、mRVSP和RVMI均明顯增高，肺小動(dòng)脈平滑肌層明顯增厚，管腔減小，肺內(nèi)小動(dòng)脈管腔面積與其橫截面積的比值明顯減少，以及肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁厚度與其半徑的比值顯著增加，提示MCT誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生顯著PAH及右心室肥大；②在肺動(dòng)脈TRPC1-7亞型中，TRPC1和TRPC4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高；③SOCC通道激動(dòng)劑CPA誘導(dǎo)的PAs收縮效應(yīng)及PASMCs的[Ca2+]i也顯著升高（P<0.01）

6、，提示MCT上調(diào)了SOCE功能；④TRPC1 mRNA表達(dá)上調(diào)量高于TRPC4，峰值出現(xiàn)時(shí)間早于TRPC4，TRPC1 mRNA表達(dá)時(shí)間曲線與CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)時(shí)間曲線一致；⑤MCT組ET-1誘發(fā)的PAs收縮效應(yīng)的量效曲線明顯左移；⑥MCT大鼠中SOCE的阻斷劑鑭系元素Gd3+、La3+、非選擇性陽(yáng)離子通道阻斷劑SK&F-96365和鈣釋放激活通道（CRAC）阻斷劑BTP-2對(duì)10nM ET-1引起的PAs收縮效應(yīng)的阻斷作用顯著增

7、強(qiáng)，且Gd3+和La3+對(duì)10nM ET-1引起的PASMCs的[Ca2+]i增加的抑制作用顯著高于CON組。
　　結(jié)論：MCT誘發(fā)的大鼠PAH，與肺動(dòng)脈TRPC1/4表達(dá)增加以及其介導(dǎo)的SOCE增強(qiáng)有關(guān)，且上調(diào)的TRPC1/4/SOCE在MCT大鼠ET-1高反應(yīng)性中起重要作用，TRPC1 mRNA表達(dá)上調(diào)量高于TRPC4，峰值出現(xiàn)時(shí)間早于TRPC4，TRPC1 mRNA表達(dá)時(shí)間曲線與CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)時(shí)間曲線一致；支持TR

8、PC1介導(dǎo)SOCE是PAH/PH發(fā)病過(guò)程中一個(gè)重要信號(hào)分子這一假說(shuō)。
　　第二部分 野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TRPC通路信號(hào)分子的變化
　　目的：通過(guò)觀察MCT致PAH大鼠肺動(dòng)脈TRPC通路信號(hào)分子（STIM-Orai-TRPC-CaN-NAFT）的變化，探討整個(gè)信號(hào)通路在MCT誘發(fā)的大鼠PAH發(fā)病過(guò)程中的作用和機(jī)制。
　　方法：采用real-time RT-PCR方法檢測(cè)該信號(hào)通路中相關(guān)信號(hào)分子的mRNA表達(dá)變

9、化，并進(jìn)一步用Western blot驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)變化。針對(duì)有變化的信號(hào)分子進(jìn)行mRNA表達(dá)時(shí)間曲線檢測(cè)，分析這些信號(hào)分子表達(dá)變化與CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)和mRVP時(shí)間曲線之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：①在TRPC上游信號(hào)分子（STIM和Orai）中，MCT預(yù)處理上調(diào)了STIM2、Orai1和Orai2 mRNA的表達(dá)，STIM1和Orai3 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，Westen-blot結(jié)果與real-time RT-

10、PCR結(jié)果相一致。②在TRPC下游信號(hào)分子（CaN和NFAT）中，MCT上調(diào)了CaNBβ、NFATc3和NFATc4 mRNA的表達(dá)，而CaNAα/β/γ、CaNBα和NFATc1/2表達(dá)變化無(wú)顯著性差異。③表達(dá)上調(diào)的這些信號(hào)分子進(jìn)行mRNA表達(dá)時(shí)間曲線檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4在MCT注射后早期（3d）mRNA表達(dá)即出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，隨后（5d）達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，并一直維持到3w，

11、而mRVP峰值出現(xiàn)在2w后，信號(hào)分子上調(diào)先于mRVP的升高，提示MCT可能通過(guò)上調(diào)STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4誘發(fā)PAH，這種上調(diào)可能是PAH產(chǎn)生的原因。④CPA誘發(fā)的PAs收縮效應(yīng)時(shí)間曲線與STIM2、Orai2以及CaNBβ表達(dá)時(shí)間曲線的存在很強(qiáng)的相關(guān)性；與TRPC1表達(dá)時(shí)間曲線的相關(guān)性顯示其R值為0.716（P=0.071），TRPC1時(shí)間曲線分別與STIM2、Orai1、CaNBβ、

12、NFATc4表達(dá)時(shí)間曲線有很強(qiáng)的相關(guān)性，CaNBβ表達(dá)時(shí)間曲線分別與mRVP、STIM2、Orai1、TRPC1、NFATc4的時(shí)間曲線與有很強(qiáng)的相關(guān)性。
　　結(jié)論：MCT預(yù)處理3w可通過(guò)上調(diào)STIM2-Orai1/Orai2-TRPC1/TRPC4-CaNBβNFATc3/NFATc4等信號(hào)分子，誘發(fā)PAH及肺血管增生。對(duì)STIM1、Orai3、CaNA/CaNBα，以及NFATc1/NFATc2等信號(hào)分子沒(méi)有影響。MCT預(yù)處理

13、后，TRPC1及其相關(guān)信號(hào)分子（TRPC1-Orai1-STIM2-CaNBβ-NFATc4）上調(diào)先于mRVP升高，TRPC1-CaNBβ可能是MCT致PAH大鼠中各信號(hào)分子表達(dá)上調(diào)，SOCE功能增強(qiáng)，并最終引起mRVP增加的中心環(huán)節(jié)和啟動(dòng)因素。
　　第三部分 環(huán)胞素A治療對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈TRPC通路信號(hào)分子變化的防治作用
　　目的：觀察CosA治療對(duì)MCT大鼠PAH的防治作用，分析肺動(dòng)脈STIM-Orai-

14、TRPC-CaN-NFAT信號(hào)通路在PAH發(fā)病過(guò)程中的作用，為藥物治療PAH尋找新靶點(diǎn)。
　　方法：將正常SD大鼠以2%MCT按照60 mg/kg劑量一次性腹腔注射，同時(shí)將CosA按35mg/kg劑量隔天腹腔注射，正常飼養(yǎng)3w，建立CosA治療MCT致肺動(dòng)脈高壓大鼠模型；測(cè)定以下指標(biāo)：①mRVSP、mRVP、RVMI、HE染色觀察肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建；②CPA誘導(dǎo)PAs收縮效應(yīng)；③ET-1誘發(fā)PAs收縮效應(yīng)量效曲線；④Gd3+對(duì)ET-1

15、誘發(fā)PAs收縮效應(yīng)的阻斷作用；⑤STIM-Orai-TRPC-CaN-NFAT信號(hào)通路中各信號(hào)分子mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：與MCT組相比，①CosA組顯著降低了mRVSP、mRVP和RVMI， HE染色可見(jiàn)肺小動(dòng)脈平滑肌層增生減弱，肺內(nèi)小動(dòng)脈管腔面積與其橫截面積的比值明顯增加，以及肺內(nèi)小動(dòng)脈管壁厚度與其半徑的比值顯著減少，提示CosA治療3w抑制了MCT誘發(fā)的PAH、肺血管重構(gòu)以及右心室肥大；②CosA治療3w后，CP

16、A誘發(fā)的PAs收縮效應(yīng)由MCT組的74.0±17.8%減少到MCT+CosA組的29.4±13.0%；MCT+CosA組中ET-1誘發(fā)PAs收縮效應(yīng)量效曲線較之MCT組明顯右移，EC50由MCT組的0.95±0.38nM增加到MCT+CosA組的3.26±0.38nM；③CosA治療抑制了TRPC1/TRPC4 mRNA表達(dá)的上調(diào)，以及其上游的Orai2、下游的CaNBβ和NFATc3 mRNA表達(dá)的上調(diào)，而對(duì)STIM2和NFATc4

17、mRNA表達(dá)的上調(diào)無(wú)影響。
　　結(jié)論：CosA治療MCT致PAH大鼠模型3w，可抑制MCT誘發(fā)的PAH、肺血管增生以及右心室肥大，抑制MCT大鼠肺動(dòng)脈中TRPC1/4表達(dá)上調(diào)所介導(dǎo)的SOCE增強(qiáng)引起肺動(dòng)脈收縮張力增大，以及對(duì)ET-1的高反應(yīng)性。CosA治療可能通過(guò)抑制Orai2-TRPC1/4-CaNBβ-NFATc3等信號(hào)分子上調(diào)從而達(dá)到抑制PAH發(fā)生發(fā)展的作用。
　　綜合上述，TRPC1介導(dǎo)SOCE是MCT誘發(fā)大鼠PAH

18、發(fā)病過(guò)程中一個(gè)重要信號(hào)通路。結(jié)合我們先前在慢性低氧PAH大鼠中的研究結(jié)果，本研究首次提出TRPC1-SOCE是不同類型PAH發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)共同的信號(hào)通路。MCT預(yù)處理可能通過(guò)上調(diào)STIM2-Orai1-TRPC1-CaNBβ-NFATc3/NFATc4信號(hào)分子，介導(dǎo)SOCE增強(qiáng)，胞漿游離Ca2+濃度增高以及肺動(dòng)脈血管收縮張力增強(qiáng)，并進(jìn)一步誘發(fā)PAH，肺血管增生與重構(gòu)，以及右心室肥大。CosA治療可通過(guò)下調(diào)Orai2-TRPC1/TRP