去泛素化酶USP33在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家男性腫瘤發(fā)病率常年排名首位。近幾年，我國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率也快速增長(zhǎng)，成為備受關(guān)注的一種惡性腫瘤。目前，前列腺癌的主要的治療方案包括手術(shù)治療、放射治療及內(nèi)分泌治療等。對(duì)于晚期前列腺癌來(lái)說(shuō)，內(nèi)分泌治療是主要的治療方法。然而，當(dāng)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間內(nèi)分泌治療后，大部分患者會(huì)面臨腫瘤的復(fù)發(fā)，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌(Castrationresistant prostate cancer，CRPC)。一

2、旦進(jìn)入該期，針對(duì)前列腺癌的治療大多無(wú)效。因此，CRPC的治療成為臨床治療的難點(diǎn)及前列腺癌研究的熱點(diǎn)。泛素化修飾(Ubiquitinmodification)，是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-Translational Modification)，它能夠通過(guò)對(duì)特定底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾從而影響底物蛋白的降解、活化或細(xì)胞內(nèi)定位的改變。因此，它在細(xì)胞的正常生理活動(dòng)中發(fā)揮不可缺少的作用。但當(dāng)它的功能出現(xiàn)異常，也可能導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂進(jìn)

3、而導(dǎo)致疾病包括腫瘤的發(fā)生。已有大量研究表明，泛素化修飾在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)是泛素化修飾過(guò)程中一種能逆轉(zhuǎn)泛素化修飾的關(guān)鍵酶，它在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的新功能、新機(jī)制也一直是腫瘤研究中的重點(diǎn)。既往研究報(bào)道顯示去泛素化酶USP33(Ubiquitin specific protease33)在雄激素刺激前列腺癌細(xì)胞后的表達(dá)量有明顯升高，因此認(rèn)為它可能在前列腺癌生長(zhǎng)中發(fā)揮

4、一定作用，遂本課題的研究目的是探討USP33在前列腺癌（尤其是去勢(shì)抵抗性前列腺癌）中的作用及機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)前列腺各細(xì)胞系，包括RWPE，LnCap，PC3，DU145，LnCap-AI，C4-2,22RV1。采用RT-PCR方法檢測(cè)USP33在各細(xì)胞系中的表達(dá)量，通過(guò)免疫組化檢測(cè)USP33在前列腺癌組織及前列腺增生組織中的表達(dá)量并比較其差異。采用流式技術(shù)檢測(cè)USP33對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)CCK8及Transwell

5、實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)USP33對(duì)前列腺細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲能力的影響。用免疫共沉淀及質(zhì)譜分析尋找與USP33相結(jié)合的靶蛋白，通過(guò)western blotting驗(yàn)證USP33與靶蛋白的結(jié)合，并研究其對(duì)靶蛋白的修飾方式分析及作用通路。建立裸鼠的皮下荷瘤模型及瘤內(nèi)注射干擾RNA的治療模型。
　　結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)USP33在前列腺癌尤其是雄激素非依賴(Androgen Independent，AI)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在

6、不同來(lái)源的前列腺癌細(xì)胞中，前列腺癌細(xì)胞中的USP33表達(dá)量明顯高于正常前列腺細(xì)胞，其中又以雄激素非依賴細(xì)胞中更明顯。在臨床收集的前列腺標(biāo)本中，我們也發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中的USP33表達(dá)量明顯高于前列腺增生組織。在不同前列腺癌細(xì)胞系中，通過(guò)干擾及過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)USP33能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞包括雄激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。PC3細(xì)胞是用于研究雄激素非依賴前列腺癌的經(jīng)典細(xì)胞系，因此在之后的實(shí)驗(yàn)中成為本課題主要研究的細(xì)胞系

7、。PC3細(xì)胞的主要特點(diǎn)是不表達(dá)雄激素受體AR(Androgen Receptor)。在PC3細(xì)胞中干擾或過(guò)表達(dá)USP33之后，結(jié)果顯示USP33可以抑制PC3細(xì)胞的凋亡。利用Western blotting技術(shù)，發(fā)現(xiàn)干擾了USP33能夠增加PC3細(xì)胞中磷酸化JNK和P38的水平。利用免疫共沉淀及質(zhì)譜分析技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)USP33可以和DUSP1(Dua1 specificity protein phosphatase1)相互結(jié)合，并且能夠

8、通過(guò)逆轉(zhuǎn)DUSP1的K48多聚泛素化修飾而抑制它的降解從而增加DUSP1的表達(dá)量。在臨床標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn)USP33高表達(dá)的前列腺癌組織中也伴隨著DUSP1的高表達(dá)。因?yàn)镈USP1在以往的報(bào)道中能夠通過(guò)抑制JNK1/2和P38的活化而抑制不同細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此我們也檢測(cè)了USP33對(duì)AI細(xì)胞PC3凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)，干擾了USP33能夠明顯促進(jìn)PC3細(xì)胞的凋亡，但當(dāng)體系中加入DUSP1過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騄NK1/2和P38的抑制劑后

9、，這種效應(yīng)就得到了逆轉(zhuǎn)。通過(guò)荷瘤小鼠干擾RNA治療模型，我們發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)注射USP33的小干擾RNA能明顯減緩PC3細(xì)胞荷瘤組織的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:在前列腺癌細(xì)胞尤其是雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞中，USP33能夠通過(guò)去除DUSP1的K48多聚泛素化修飾，從而抑制其通過(guò)泛素蛋白酶體途徑的降解過(guò)程，提高其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)DUSP1的磷酸酶活性抑制JNK1/2和P38信號(hào)通路的活化從而抑制JNK1/2、P38依賴的細(xì)胞凋亡