藥物重定位策略在篩選去勢抵抗性前列腺癌藥物中的應(yīng)用與研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　我國前列腺癌的發(fā)病率快速上升，而且中晚期患者比例較高，預(yù)后偏差。對于晚期前列腺癌患者，目前治療主要依賴于內(nèi)分泌治療，包括藥物去勢治療、抗雄激素治療、新一代雄激素生物合成抑制劑治療，可有效控制患者病情進(jìn)展。但絕大多數(shù)患者仍會(huì)出現(xiàn)去勢抵抗，并伴有轉(zhuǎn)移。因此，利用現(xiàn)有去勢抵抗性前列腺癌的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)，繼續(xù)開發(fā)新型、有效的治療藥物，仍是該領(lǐng)域研究的的迫切任務(wù)。但是新藥研發(fā)依然面臨著研發(fā)周期長，人力、資金成本高、

2、成功概率低等困難。在新藥研發(fā)的多種不利因素的制約下，以及精準(zhǔn)醫(yī)療對個(gè)性化用藥的迫切需求，藥物重定位(DrugReposition)策略，也稱作為老藥新用，即整合挖掘現(xiàn)已有的藥物未知的新用途，因其具有較高的投入產(chǎn)出效率，目前已經(jīng)成為目前抗癌藥物研發(fā)中的重要策略之一。公共數(shù)據(jù)庫CMap(Connectivity map，CMap)是目前較為完善基于藥物基因表達(dá)譜的藥物研究平臺，是藥物重定位研究中重要的工具之一。本課題的研究目的主要就是應(yīng)用藥

3、物重定位策略，基于基因表達(dá)譜，篩選可治療去勢抵抗性前列腺癌藥物，并研究其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　從NCBI網(wǎng)站的GEO免費(fèi)共享數(shù)據(jù)庫下載涵蓋有激素敏感性前列腺癌原位病灶組織與去勢抵抗性前列腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集GSE32269。利用R語言軟件，通過線性回歸和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法(limma)分析兩類組織的差異基因。并行GO分析和KEGG通路分析。隨后將差異基因轉(zhuǎn)換為探針號，導(dǎo)入CMap數(shù)據(jù)庫平臺，進(jìn)行基因

4、表達(dá)譜比對、評分。我們挑選前列腺癌細(xì)胞系PC3的比對結(jié)果，以p≤0.05，enrichment≤-0.8，mean≤-0.6為藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到9個(gè)候選藥物。結(jié)合CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，以及藥物信息查詢（Drugbank，SuperTarget），確定候選藥物胍那芐。體外實(shí)驗(yàn)，主要通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，transwell小室穿梭實(shí)驗(yàn)（有或無matrigel覆蓋孔膜），wester

5、n blot實(shí)驗(yàn)，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，免疫組化，免疫熒光等明確胍那芐對去勢抵抗性前列腺癌有抑制細(xì)胞增殖、克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷徙、侵襲等惡性生物學(xué)表型。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶和mCherry熒光蛋白的PC3細(xì)胞，并主要通過構(gòu)建基于PC3細(xì)胞的皮下移植瘤、脛骨平臺注射小鼠模型，并用游標(biāo)卡尺監(jiān)測皮下移植瘤生長，應(yīng)用活體成像儀檢測肺、脛骨部位腫瘤負(fù)荷。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　（一）第一部分
　　分析基因

6、表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE32269，發(fā)現(xiàn)兩類組織的基因表達(dá)顯著差異，在去勢抵抗性前列腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶組織中，其中有93個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，149個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)。GO分析顯示，差異基因主要富集于細(xì)胞外區(qū)、結(jié)構(gòu)分子活性、細(xì)胞粘附等。KEGG通路分析差異基因主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)互作，焦點(diǎn)粘附，谷胱甘肽代謝，氨基糖與核苷酸糖代謝。基因相應(yīng)探針號導(dǎo)入CMap數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因表達(dá)譜比對、評分。我們挑選前列腺癌細(xì)胞系PC3的比對結(jié)果，以p≤0.05，en

7、richment≤-0.8，mean≤-0.6為藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到9個(gè)候選藥物。
　　（二）第二部分
　　CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明胍那芐顯著抑制去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成，且為呈濃度依賴性抑制。AnnexinⅤ-FITC/PI標(biāo)記雙標(biāo)流式檢測表明胍那芐顯著促進(jìn)去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室穿梭實(shí)驗(yàn)表明，胍那芐可以抑制前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力。RT-qPCR，Wes

8、tern blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明胍那芐還可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化改變?；赑C3細(xì)胞的皮下移植瘤、脛骨平臺注射骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，胍那芐可明顯抑制抑制瘤生長、轉(zhuǎn)移灶腫瘤負(fù)荷增長。
　　（三）第三部分
　　RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明去勢抵抗性前列腺癌的GADD34的mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯高于雄激素依賴前列腺癌細(xì)胞以及正常前列腺上皮細(xì)胞。GADD34在去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于

9、雄激素依賴前列腺癌及正常前列腺癌上皮細(xì)胞。且胍那芐可以抑制p-eiF2α的脫磷酸化。當(dāng)敲減GADD34時(shí)，去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制，但與此同時(shí)，體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)敲減GADD34后，腫瘤細(xì)胞對對胍那芐的敏感性也明顯所降低。
　　結(jié)論：
　　（一）去勢抵抗性前列腺癌較激素敏感性前列腺癌基因表達(dá)有較大變化，基于該差異基因表達(dá)譜進(jìn)行藥物重定位研究是可行、有效的。
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