MYSM1在去勢抵抗性前列腺癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌是全世界男性癌癥死亡的最常見的原因之一。很多器官局限性前列腺癌患者在行根治性前列腺切除術(shù)或局部放療后腫瘤再次復(fù)發(fā)并進(jìn)展。在分子水平上，雄激素激活雄激素受體（AR），作為核受體轉(zhuǎn)錄因子參與了特定致瘤基因的表達(dá)。因此，進(jìn)展期的前列腺癌治療主要以抑制雄激素的合成和拮抗AR的雄激素剝奪療法為主。然而，大多數(shù)患者會(huì)對治療產(chǎn)生耐藥性，并隨后發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），在大多數(shù)情況下，CRPC仍然依賴于AR信號(hào)通路

2、。CRPC往往是致命的，故而改進(jìn)對前列腺癌的治療顯得尤為迫切。AR如何調(diào)控CRPC生長并未完全闡釋清楚，但肯定是通過特定的機(jī)制使AR能夠在較低水平的雄激素下得以活化。
　　組蛋白泛素化是表觀遺傳修飾的重要形式之一，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)等事件。MYSM1是組蛋白H2A特異性去泛素化酶，其N端的JAMM結(jié)構(gòu)域是金屬酶共有的結(jié)構(gòu)域，具有金屬蛋白酶的水解活性，能夠去除泛素分子。MYSM1的分子結(jié)構(gòu)決定了它能夠在胞核內(nèi)

3、去除泛素化的組蛋白，文獻(xiàn)和課題組前期工作證實(shí)MYSM1對造血干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞的發(fā)育及功能十分重要。雖然組蛋白泛素化修飾與腫瘤關(guān)系密切，但MYSM1在腫瘤中的作用尚無報(bào)道。研究表明，MYSM1參與了基因組穩(wěn)定性的維持及細(xì)胞增殖過程，這提示MYSM1可能在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。為探明MYSM1對腫瘤的作用及其機(jī)制，本課題擬驗(yàn)證MYSM1與前列腺癌的相關(guān)性，明確其在前列腺癌發(fā)生中的作用，尋找并確定MYSM1的靶基因，探索MYSM1調(diào)控基

4、因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，從而為前列腺癌的診療和預(yù)后判斷提供潛在的靶點(diǎn)和標(biāo)志物。
　　目的：
　　探討MYSM1在去勢抵抗性前列腺癌中的生物學(xué)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、利用公共數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas）中相關(guān)結(jié)果明確MYSM1在前列腺癌中的表達(dá)情況；
　　2、應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)MYSM1的表達(dá)，通過qRT-PCR、Western blot對MYSM1表達(dá)水平進(jìn)行鑒定；

5、
　　3、通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞增殖的影響；
　　4、通過流式細(xì)胞儀分析下調(diào)MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響；
　　5、通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞遷移能力的影響；
　　6、通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)MYSM1對去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響；
　　7、通過Co-IP方法證實(shí)MYSM1與AR的相互作用，通過C

6、hIP方法進(jìn)一步驗(yàn)證MYSM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；
　　8、通過Western blot法檢測下調(diào)MYSM1對Akt/GSK-3β/C-Raf信號(hào)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1、MYSM1在前列腺癌中表達(dá)降低。
　　在公共數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas）中查找并分析MYSM1在前列腺癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相較于正常前列腺組織，MYSM1在前列腺癌中表達(dá)降低，其表達(dá)水平與前列腺癌的惡性程度成

7、負(fù)相關(guān)。
　　2、MYSM1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株及對照細(xì)胞株的建立。
　　用MYSM1的干擾慢病毒感染去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞（C4-2、22Rv1），應(yīng)用嘌呤霉素持續(xù)篩選一周，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)細(xì)胞綠色熒光皆為陽性；取篩選后的細(xì)胞，分別提取RNA及蛋白，通過qRT-PCR法檢測MYSM1的mRNA水平，Western blot法檢測MYSM1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾慢病毒能夠顯著下調(diào)MYSM1的m

8、RNA及蛋白表達(dá)水平。
　　3、MYSM1能夠明顯抑制去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞的生長。
　　應(yīng)用干擾慢病毒下調(diào)去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞（C4-2、22Rv1）中MYSM1的表達(dá)，進(jìn)行一系列體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)MYSM1能夠顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長；流式細(xì)胞儀周期檢測結(jié)果顯示，下調(diào)MYSM1使G1期細(xì)胞減少，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)MYSM1能夠顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力；流式

9、細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)MYSM1對前列腺癌細(xì)胞凋亡及遷移能力并無顯著影響。
　　4、MYSM1能夠與AR相互作用，通過影響AR信號(hào)通路介導(dǎo)前列腺癌的生長。
　　有研究證實(shí)，MYSM1能夠協(xié)調(diào)組蛋白的乙?；c去泛素化進(jìn)而參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)MYSM1與AR的表達(dá)成正相關(guān)，但是，我們在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)，下調(diào)MYSM1并不影響AR的蛋白表達(dá)水平。下調(diào)MYSM1能夠促進(jìn)AR下游靶基因的表

10、達(dá)，免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MYSM1與AR存在相互作用，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，MYSM1能夠調(diào)控雄激素反應(yīng)元件（AREs）區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響AR信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄。
　　5、MYSM1能夠抑制Akt/GSK-3β/C-Raf信號(hào)通路，抑制前列腺癌的生長。
　　雄激素作用的發(fā)揮既可以通過經(jīng)典的雄激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控雄激素反應(yīng)元件；也可以經(jīng)由雄激素受體非依賴的信號(hào)通路

11、，通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路從而參與腫瘤的生長。我們發(fā)現(xiàn)，MYSM1除了與AR直接結(jié)合影響經(jīng)典信的AR信號(hào)通路外，對非經(jīng)典的PI3K/Akt信號(hào)通路也有影響。下調(diào)MYSM1可以促進(jìn)Akt、GSK-3β、C-Raf的磷酸化，同時(shí)，p53表達(dá)降低，c-Myc表達(dá)升高，激活A(yù)kt/GSK-3β/C-Raf信號(hào)通路，促進(jìn)前列腺癌的生長。
　　結(jié)論：MYSM1作為一個(gè)重要的表觀遺傳分子，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其作用