ELL2在前列腺癌中的功能與泛素化的研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先以臨床患者前列腺的病理標本為研究對象，應用免疫組化技術檢測人體前列腺癌組織與正常前列腺組織中ELL2表達差異，觀察隨著前列腺癌的惡性程度增高，ELL2表達趨勢的改變;繼而以前列腺癌C4-2細胞為研究對象，分別瞬時轉染ELL2-siRNA下調ELL2基因表達與Flag-ELL2質粒上調其表達，利用MTT實驗、流式細胞技術、Transwell小室技術等觀察對前列腺癌細胞增殖能力、凋亡率、侵襲力與遷移的影響;利用W

2、estern-Blot觀察增殖相關蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3與PARP、侵襲性與遷移能力相關因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表達變化的表達變化，探討ELL2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制。關于ELL2泛素化相關研究:以前列腺癌C4-2細胞為研究對象，通過降解時間對比與免疫共沉淀實驗證實ELL2是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白。應用質粒重建與

3、點突變技術，鑒定ELL2泛素化位點。以293細胞為研究對象，把EAF1、EAF2分別與ELL2共同瞬時轉染后通過降解時間對比與泛素化免疫共沉淀實驗鑒定EAF1與EAF2是否影響ELL2降解。最后，將ELL2與野生型泛素或不同的泛素賴氨酸殘基突變體共同轉染，免疫共沉淀實驗鑒定參與ELL2泛素化的泛素賴氨酸殘基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用，為調控ELL2在細胞內的蛋白濃度，進一步研發(fā)治療前列腺癌的靶點與藥物奠定基礎。
　　方

4、法：
　　1.ELL2在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　1.1、ELL2在前列腺癌中的表達
　　分別收集臨床前列腺癌組織29例及正常組織22例，免疫組織化學方法檢測ELL2在這兩種不同組織中的表達情況。
　　1.2、雄激素作用下對前列腺癌細胞ELL2表達的影響
　　用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌細胞株LNCaP和C4-2，Western blot和Real-tim

5、e PCR檢測不同濃度及不同作用時間R1881對ELL2的影響。
　　1.3、ELL2對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　分別用ELL2-siRNA和Flag-ELL2質粒轉染前列腺癌C4-2細胞，應用MTT方法檢測細胞增殖率的變化;應用流式細胞技術檢測細胞凋亡率的變化;Western blot方法檢測增殖細胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的變化;應用Transwell小室檢測細胞侵襲、遷移能

6、力的改變;Western blot方法檢測MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表達變化。
　　2.ELL2泛素化降解關鍵片段、位點的研究;EAF1/EAF2對ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究
　　2.1、ELL2蛋白穩(wěn)定性的檢測
　　用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2細胞表達ELL2蛋白后，應用CHX抑制蛋白合成，Weste

7、rn blot檢測每小時ELL2蛋白水平，連續(xù)5小時;分別用C4-2細胞及轉染ELL2的293細胞，檢測蛋白合成抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132對內源性及外源性ELL2降解的影響。
　　2.2、ELL2泛素化途徑降解及降解片段、位點的檢測
　　Flag-ELL2與HA-Ub質粒共轉染293細胞，MG132抑制蛋白酶體功能，應用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗，Western blot檢測泛素表達情況;之后，將不同E

8、LL2片段的Flag載體重組質粒（片段1:aal-aa292，片段2:aa293-aa531，片段3:aa532-aa640）轉染C4-2細胞，應用CHX抑制蛋白合成后，Western blot檢測各片段4h、8h、12h、24h與1h、2h、3h、4h時間點Flag表達水平，對片段3加測15min、30min、45min、60min、75min時間點Flag表達水平;最后，將ELL2片段3(aa532-640)所包括的9個賴氨酸，均制

9、備Flag載體K/R點突變質粒并轉染C4-2細胞，應用CHX抑制蛋白合成，Western blot檢測時間點0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的變化。
　　結果：
　　1.ELL2在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　1.1、ELL2在前列腺癌中的表達降低
　　免疫組化結果顯示，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中ELL2表達明顯降低(P＜0.05)，且隨著Gleason評

10、分的增高，ELL2表達呈逐漸降低的趨勢(P＜0.01)。
　　1.2、ELL2表現(xiàn)為雄激素依賴性
　　Western blot和Real-time PCR結果顯示，R1881刺激后，LNCaP和C4-2細胞中ELL2蛋白(P＜0.05)及mRNA(P＜0.05)水平均升高，且在一定范圍內表現(xiàn)為劑量、時間依賴性。
　　1.3、ELL2對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響
　　MTT結果顯示，前列腺癌C4-2細

11、胞在轉染ELL2-siRNA后，細胞增殖率上升(P＜0.001) PCNA在蛋白水平上升(P＜0.05)，而在轉染Flag-ELL2后，增殖率下降(P＜0.001)，PCNA在蛋白水平下降(P＜0.05);流式細胞儀結果顯示，轉染ELL2-siRNA組凋亡率下降(P＜0.05)，而轉染Flag-ELL2組凋亡率升高(P＜0.01)，Western blot結果顯示:轉染ELL2-siRNA組Caspase3、PARP蛋白水平下降(P＜0

12、.05; P＜0.01)，而轉染Flag-ELL2組Caspase3、PARP蛋白水平升高(P＜0.001;P＜0.001);Transwell結果顯示，轉染ELL2-siRNA組細胞侵襲、遷移能力均增加(P＜0.01，0.05;P＜0.01，P＜0.05)，MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01)，N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P＜0.05;P＜0.05)，E-cadh

13、erin蛋白水平降低(P＜0.05)，而轉染Flag-ELL2組細胞侵襲、遷移能力則下降(P＜0.01;P＜0.01)，MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01)，N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P＜0.01;P＜0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P＜0.001)。
　　2.ELL2泛素化降解關鍵片段、位點的研究;EAF1/EAF2對ELL2降解的影響;參與

14、ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究
　　2.1、ELL2是不穩(wěn)定蛋白
　　Western blot結果顯示，應用CHX抑制蛋白合成后，ELL2蛋白水平逐漸下降，到5小時降至起點的20％以下;Western blot結果顯示，無論是內源性還是外源性合成的ELL2蛋白，應用蛋白酶體抑制劑MG132后，ELL2蛋白水平均明顯高于對照組(P＜0.05; P＜0.05)。
　　2.2、ELL2經(jīng)泛素化途徑降解;片段3(aa532

15、-aa640)對于維持其蛋白穩(wěn)定性較重要;K571、K584、K599三個賴氨酸位點的突變有助于其維持蛋白結構的穩(wěn)定性
　　Flag-ELL2與泛素共同轉染293細胞，應用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗，Western blot結果顯示，應用MG132抑制蛋白酶體后，在ELL2蛋白上方區(qū)域可見到明顯的泛素條帶，而對照組無泛素條帶;不同片段的ELL2載體轉染C4-2細胞后，Western blot結果顯示，片段3(aa532-

16、aa640)降解速度明顯快于其他兩段，75min時已經(jīng)大部分降解;片段2(aa293-aa531)最穩(wěn)定，12h時降解尚不明顯;片段1(aal-aa292)降解速度居中;不同位點的ELL2突變體轉染至細胞后，Western blot結果顯示，突變體K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明顯較野生型ELL2慢，其他突變體與野生型ELL2相似。
　　結論：
　　1.ELL2在人體前列腺癌組織中表達降低，且與腫瘤惡性度

17、相關。
　　2.ELL2是雄激素反應蛋白，其表達的異?？赡芘c去勢抵抗性前列腺癌的進展相關。
　　3.ELL2蛋白上調在一定程度上可抑制前列腺癌細胞的增殖，增加其凋亡率，并抑制其侵襲、遷移能力，ELL2參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　4.ELL2蛋白在體內經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，其與泛素結合位點主要在氨基酸片段aa532-aa640中，該片段在維持ELL2的穩(wěn)定性上最為重要，K571、K584、K599三個賴氨酸是