RACK1蛋白在前列腺癌中的功能研究.pdf

1、前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在歐美，尤其在美國前列腺癌的發(fā)病率仍超過肺癌，高居第一位；目前，我國前列腺癌發(fā)病率雖遠低于西方國家，但近年來隨著人們生活方式的改變、壽命的延長及醫(yī)療保健和診斷水平的提高，我國前列腺癌發(fā)病率呈顯著增長趨勢。腫瘤的浸潤和轉移是導致前列腺癌患者死亡的主要原因，前列腺癌細胞如何獲得侵襲轉移潛能目前尚不十分清楚。因此探討前列腺癌侵襲轉移的分子機制，尋找新的抑制其侵襲轉移的治療靶點有重要的理論意義和臨床實用

2、價值。
　　RACK1是一種高度保守的細胞內銜接蛋白，與G蛋白β亞單位同源。現在已證實RACK1能與大量蛋白質直接作用或者作為更大的復合物的部分與其作用。然而，作為支架蛋白，RACK1參與整合來自不同的信號轉導途徑的信息，對于基本的細胞活動至關重要，比如細胞增殖、轉錄和蛋白質合成以及不同的神經功能。在癌癥中， RACK1成為變換信號的焦點。RACK1募集了核糖體和PKC并且為MAPK途徑提供支持以及成為 PI3K通路的中心成分，另

3、外，RACK1還支持許多其他不同的激酶和磷酸酶，而且發(fā)現許多蛋白的活性在癌癥中改變。所有這些蛋白，信號轉導途徑和蛋白復合物都需要嚴格的調節(jié)。RACK1的表達（上調和下調）發(fā)生的細微變化，可以對這些重要調節(jié)途徑有關的腫瘤疾病的發(fā)展產生巨大影響。
　　本課題試圖從人體前列腺癌組織、人前列腺癌細胞株、裸鼠移植瘤模型三方面對RACK1表達與前列腺癌生物學行為的相關關系及其作用的分子機制進行研究，以尋找預測人前列腺癌轉移的分子生物學標記物及

4、分子治療的新靶點。故該課題的研究不僅對了解腫瘤的生物學特性具有明顯的理論意義，也具有顯著的臨床價值和社會效益。
　　第一部分前列腺癌組織中RACK1、PTEN、Ki67的表達
　　目的：探討RACK1、PTEN和Ki67在前列腺癌中的表達情況，并研究這三種蛋白與前列腺癌臨床分期和病理分級的關系。
　　方法：42例前列腺癌標本(57～87歲，平均66.7歲)取自蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科2003～2011年的手術標本及

5、經直腸穿刺活檢存檔蠟塊，標本系10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。前列腺癌標本按照Gleason評分。前列腺癌患者術前均未接受內分泌治療或其他治療。標本4μm厚連續(xù)切片，分別做RACK1、PTEN和Ki67免疫組化染色，分析其表達水平與前列腺癌臨床病理參數的關系。
　　結果：42例前列腺癌組織標本中，RACK1有不同程度的表達，其中5例評分為3級，11例評分為2級，有14例評分為1級，有12例評分為0級；PTEN表達缺失(32/42

6、，76.19%)；有29例Ki67(29/42，69.04%)異常高表達；RACK1的表達與Ki67有很強的相關性，經Pearson’s相關分析，兩者的相關系數高達0.721，P﹤0.001；另外，RACK1與PTEN呈負相關；Kaplan-Meier生存分析揭示，RACK1的高表達與前列腺癌患者較短的生存期之間有顯著相關性(P﹤0.001)；單、多因素生存分析顯示RACK1蛋白在前列腺癌患者預后分析中是一個獨立的有預后意義的分子指標(

7、P=0.005)。
　　結論：（1）人前列腺癌組織中有RACK1表達，且其表達與前列腺癌臨床分期和病理分級相關；
　?。?）RACK1和Ki67的陽性表達、PTEN的表達缺失均與前列腺癌的臨床分期和病理分級相關。而RACK1在前列腺癌患者生存分析中是一個獨立的有意義的預后分子指標，與其他前列腺癌臨床常用分子指標相比，RACK1具有更大的優(yōu)越性和更廣闊的應用前景。
　　第二部分 RACK1對前列腺癌細胞增殖侵襲的影響

8、r>　　目的：研究RACK1干擾對前列腺癌細胞增殖侵襲的影響。
　　方法：以前列腺癌細胞株 DU145、LNcap為研究對象，利用脂質體介導轉染技術將RACK1 siRNA轉染前列腺癌細胞，經G418篩選得到穩(wěn)定的干擾細胞模型；采用生長曲線和流式細胞技術研究RACK1對人前列腺癌細胞體外增殖的影響；使用劃痕實驗和 transwell遷移實驗研究 RACK1對其體外遷移運動能力的影響；應用transwell侵襲實驗研究RACK1對人

9、前列腺癌細胞體外侵襲運動能力的影響；同時建立裸鼠移植瘤模型，從體內角度研究RACK1干擾對前列腺癌增殖、侵襲的影響。結果：獲得穩(wěn)定RACK1 siRNA干擾表達的DU145和LNcaP細胞株；體外實驗表明，與對照組相比，干擾后細胞的增殖遷移能力和克隆形成都面向減弱。在裸鼠移植瘤實驗中發(fā)現，RACK1干擾細胞組裸鼠移植瘤生長較對照組明顯減慢，腫瘤的體積和重量明顯減少，侵襲性明顯下降。
　　結論：（1）采用脂質體介導法將 pSUPER

10、-si1/si2/scramb-siRNA成功轉染人前列腺癌細胞DU145和LNCaP，獲得穩(wěn)定干擾表達RACK1的細胞株。
　?。?）RACK1干擾在體內、外均能抑制人前列腺癌細胞增殖、遷移運動和侵襲能力。
　　第三部分 RACK1對前列腺癌細胞增殖侵襲的分子機制研究
　　目的：闡明RACK1對前列腺癌細胞增殖侵襲的作用和促進腫瘤血管形成的相關機制。
　　方法:采用Western blot的方法檢測前列腺癌細胞

11、RACK1和RACK1 siRNA干擾后，PI3K/Akt和MAPK等信號通路分子活性的變化；采用IHC檢測RACK1干擾后血管內皮細胞標志分子CD31的表達，采用MVD計算新生血管數量；采用real-time PCR技術檢測VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, Ang1, Ang2, HGF, FGF2,和PIGF等血管生成因子水平。并比較血管生成因子和信號通路分子在時間過程上的相互關系。
　　結果：轉染 siRNA干

12、擾的前列腺癌細胞株，與空載對照組相比p-Akt、p-MAPK的表達顯著下降，而PLC未受影響。裸鼠成瘤IHC結果顯示，RACK1干擾后血管內皮標志分子CD31的表達顯著減少，顯著影響了MVD。利用real-time PCR檢測裸鼠移植瘤各種血管生成因子顯示，VEGF-B, FGF2 mRNA的表達被顯著抑制達40-50%。p-Akt和 p-MAPK的抑制發(fā)生在較晚的時間，證明他們而不是參與抑制VEGF-B和FGF2翻譯的上游信號分子。<

13、br>　　結論：（1）RACK1的siRNAs干擾抑制Akt和MAPK的磷酸化而不是PLC，影響了前列腺癌細胞的增殖侵襲能力。
　?。?） RACK1 siRNAs干擾下調VEGF-B、FGF2的表達進而抑制腫瘤新生血管的形成。
　?。?） Akt/MAPK信號通路不是VEGF-B和FGF2抑制的上游信號分子。
　?。?）通過動物成瘤鑒定了 siRNAs干擾引起 RACK1表達的下調，導致了Akt/MAPK磷酸化水平下