前列腺癌患者血清microRNA表達(dá)特點(diǎn)及miR-21在前列腺癌細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、研究目的:
　　一、microRNA廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織內(nèi),血清microRNA的研究報(bào)道不多,在前列腺癌中更是罕有報(bào)道。本研究根據(jù)已有的microRNA差異表達(dá)譜篩選在前列腺癌中高表達(dá)的microRNA(主要有miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141),在前列腺癌患者血清中檢測這些microRNA的表達(dá)情況,比較不同microRNA在前列腺癌的不同疾病階段的表達(dá)情況及其與骨轉(zhuǎn)移、預(yù)后和治療有效性的相關(guān)性。

2、
　　二、根據(jù)第一部分的研究結(jié)果,通過檢測血清microRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-21在激素抵抗性前列腺癌患血清者中的表達(dá)顯著高于激素敏感性前列腺癌患者,而且miR-21隨著血清PSA的升高而升高,提示miR-21可能對(duì)前列腺細(xì)胞的生長增殖有一定作用,而抑制細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)有望抑制前列腺癌細(xì)胞的生長,甚至于逆轉(zhuǎn)雄激素非依賴狀態(tài)。為了探討其中產(chǎn)生差異的機(jī)制,本課題進(jìn)一步研究miR-21反義寡核苷酸對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的

3、生長的抑制作用及其內(nèi)在分子機(jī)制。
　　材料和方法:
　　一、采用特異性TaqMan探針的實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測56例患者(包括局限性前列腺癌20例,激素敏感性骨轉(zhuǎn)移前列腺癌20例,激素抵抗性骨轉(zhuǎn)移前列腺癌10例,良性前列腺增生6例)血清中的miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141,U6snRNA作為內(nèi)參。方差檢驗(yàn)比較以上4類患者血清中miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141表達(dá)差異

4、,探尋診治方案選擇及預(yù)后判斷的新指標(biāo)。
　　二、將特異性miR-21反義寡核苷酸,通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染LNCaP前列腺癌細(xì)胞,觀察前列腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的增殖情況,繪制腫瘤細(xì)胞增殖曲線;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別提取腫瘤細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)的蛋白,采用western-blotting方法分別檢測胞漿、胞核內(nèi)PTEN、mTOR、AKT、AR、PSA等蛋白的表達(dá)情況。比較轉(zhuǎn)染特異性miR-21寡核苷酸對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞增殖的影響和腫瘤細(xì)胞內(nèi)

5、蛋白的影響。
　　結(jié)果:
　　一、miR-21在激素抵抗性骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患血清者中的表達(dá)顯著高于激素敏感性骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患者,p=0.016。分層分析顯示,激素敏感性前列腺癌患者中,PSA小于4ng/ml的患者的血清miR-21表達(dá)顯著低于PSA大于4ng/ml的
　　患者;對(duì)多西他賽化療抵抗的前列腺癌患者的血清miR-21表達(dá)明顯高于對(duì)多西他賽化療敏感的患者,p=0.032。而miR-20a和miR-125b在4組患

6、者中未顯示存在差異表達(dá)。miR-141在骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患者血清中的表達(dá)顯著高于無骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌和良性前列腺增生患者,p=0.006;并且miR-141的表達(dá)水平與骨轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)呈正相關(guān)性,p＜0.001。血清miR-21和miR141與前列腺癌Gleason評(píng)分呈正相關(guān),G1eason評(píng)分＞7分的患者的血清microRNA表達(dá)水平顯著高于Gleason評(píng)分＜=7分的患者,p值分別為0.001和＜0.001。
　　二、細(xì)胞生長曲線顯

7、示,在特異性miR-21反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后,前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞核內(nèi)的雄激素受體(AR)蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),細(xì)胞漿中無AR蛋白表達(dá);胞漿內(nèi)的前列腺特異抗原(PSA)蛋白的表達(dá)也明顯下降,細(xì)胞核中無PSA蛋白的表達(dá)。此外,在轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞核內(nèi)的AKT蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),而細(xì)胞漿中的AKT蛋白表達(dá)變化不明顯;mTOR蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)也明顯下降,但細(xì)胞核中的mTOR蛋白的表達(dá)反而升高。
　　結(jié)論:

8、
　　在前列腺癌患者血清中檢測microRNA是可行的,miR-21高表達(dá)于雄激素非依賴的骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患者,并對(duì)多西他賽化療有效性具有預(yù)測價(jià)值;miR-141高表達(dá)于骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患者。miR-21可以作為雄激素非依賴前列腺癌的分子標(biāo)記物,而miR-141可作為骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌的分子標(biāo)記物。
　　抑制LNCaP前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的miR-21表達(dá)對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,其內(nèi)在機(jī)制可能是miR-21有上調(diào)AKT表達(dá)的作用,進(jìn)