LAMA4及相關lncRNA在前列腺癌組織中的差異表達,以及其對前列腺癌細胞轉移能力影響的研究.pdf

1、目的：
　　利用微陣列基因芯片技術檢測前列腺癌（PCa）、和癌旁正常組織中差異表達的mRNA和lncRNA。觀察前列腺癌與癌旁正常組織基因表達的變化，進而發(fā)現(xiàn)LAMA4基因及其相應lncRNA，為前列腺癌轉移提供分子層面的新證據(jù)，以期為臨床前列腺癌的預防、診療，以及發(fā)病機制提供新理論及新方案。
　　方法：
　　收集2013年8月至2014年8月我院前列腺切除術后臨床組織標本共20例，通過改進標本獲取方式，運輸途徑，破碎

2、方法三方面因素，建立從離體組織標本提取高質量總RNA的方法。隨后在此方法基礎上，通過冰凍切片結合手工顯微切割技術在同一前列腺組織標本中分離出PCa、癌旁正常組織各區(qū)域的純凈細胞群。采用lncRNA+mRNA表達譜芯片分析三者間的基因表達差異（生物學重復3次），通過生物信息學的方法篩選出具有顯著表達差異的mRNA和lncRNA，并對結果進行Pathway分析等初步的生物信息學分析，反向Cis-預測lncRNA的靶基因，在發(fā)生顯著變化的炎癥

3、和/或癌癥通路上建立lncRNA與靶基因的基因網(wǎng)絡圖。確定LAMA4及其相關lncRNA的差異表達，并通過收取2014年11月至2015年10月我院前列腺切除術后臨床組織標本6例，進行組織標本PCR驗證，培養(yǎng)DU145前列腺癌細胞系，22RV1前列腺癌細胞系，使用特異性siRNA，以LipofectamineTM2000進行轉染，進一步采取qRT-PCR驗證轉染效果，以確定是否轉染成功。對于轉染后抑制的細胞，通過transwell，劃痕

4、實驗以及MTT法細胞黏附實驗，檢測腫瘤細胞的遷移，轉移，黏附探尋lncRNA在此過程中的作用。
　　結果：
　　1.基因表達譜芯片的結果顯示：人前列腺癌組織與癌旁正常組織對照相比，有2610個mRNA表達有差異，其中上調689個，下調1921個；同時有2176個lncRNA表達有差異，其中上調688個，下調1488個。人前列腺增生性炎性萎縮組織與癌旁正常組織相比，有592個mRNA表達有差異，其中上調183個，下調409個；

5、同時有575個lncRNA表達有差異，其中上調160個，下調415個。人前列腺癌組織與前列腺增生性炎性萎縮組織相比，有1007個mRNA表達有差異，其中上調115個，下調892個；有773個lncRNA表達有差異，其中上調105個，下調668個。在3種組織類型的共同比較中，有113個mRNA的表達存在顯著線性差異，其中上調8個，下調105個；有106個lncRNA的表達也存在顯著線性差異，其中上調11個，下調95個。
　　2.LA

6、MA4基因的mRNA及其lncRNA在芯片結果中差異表達明顯，在組織標本中，組織PCR結果符合芯片結果。
　　3.轉染后細胞PCR顯示，siRNA敲底lncRNA和LAMA4mRNA水平
　　4.細胞功能學實驗表明，轉染后細胞遷移轉移能力明顯減弱。
　　結論：
　　1.冰凍切片并H&E染色結合“排除法”手工顯微切割技術，可經(jīng)濟、有效地鑒定分離出目的細胞亞群，且通過Trizol法提取的總RNA能夠滿足高通量微陣列技