Treg-Th17細胞對結核的診斷價值及高通量檢測結核免疫分子譜的應用.pdf

1、背景：
　　結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種傳染性疾病。目前結核病的疫情仍然十分嚴峻，早期、快速診斷對于結核病的治療和控制傳播都有極其重要的意義。機體抵抗結核桿菌的免疫機制主要包括體液免疫和細胞免疫，因此結核病的診斷也主要從體液免疫和細胞免疫兩個方面入手。體液免疫診斷主要是檢測患者體液中結核桿菌抗原、抗體以及免疫過程中產(chǎn)生的各種免疫分子;而細胞免疫診斷則是通過檢測細胞

2、免疫功能進行疾病的診斷，它包括T細胞的數(shù)量、功能及其產(chǎn)物如細胞因子等的檢測。目前結核病的實驗室診斷主要有痰涂片抗酸染色法、細菌培養(yǎng)法、結核桿菌PCR擴增法以及γ干擾素釋放試驗(IGRAs)等。其中痰涂片檢查陽性率低;痰培養(yǎng)需時又太長;PCR擴增法技術要求較高;IGRAs可一定程度上彌補上述不足，具有較高的靈敏度和特異性，但仍不能滿足臨床需要，不能區(qū)分結核潛伏期、活動期，對結核病不同病程的診斷也十分困難。由于不同結核感染人群存在不同免疫分

3、子譜，采用高通量檢測方法同時檢測體液免疫和細胞免疫的多個結核免疫標志物，可有效提升結核診斷陽性率，并有可能通過對結核病不同病程時免疫分子譜的表達研究，了解結核桿菌感染活動期、潛伏感染期的抗原結構、功能及表達情況，發(fā)現(xiàn)新的診斷分子標志物。
　　目的：
　　本研究旨在通過流式細胞術(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測結核感染后不同病程患者體內細胞免疫中起重要作用的調節(jié)性T細胞(Regulatory cell，Treg)和

4、TH17細胞，構建以液態(tài)芯片技術(Luminex)為平臺的多種結核免疫分子（EGF、FGF-2、Eotaxin、TGF-α、G-CSF、Fit-3L、GM-CSF、Fractalkine、IFN-α2、IFNγ、GRO、IL-10、 MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、IL-13、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、

5、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、VEGF)同時檢測的高通量檢測技術，并分析不同病程結核免疫分子譜表達情況，確定結核病的不同感染階段特有的生物學標志物，為臨床對結核患者的診斷、免疫功能和預后評估提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　1.分別采集結核感染活動期（66例）、潛伏感染期（57例）以及健康對照人群(58例)外周靜脈抗凝全血，通過流式細胞術檢測不同階段患者外周血中

6、Treg細胞和Th17細胞的表達水平，同時通過ELISA法檢測血漿中細胞因子IL-10和IL-17的表達情況，分析這兩類T淋巴細胞亞群在結核病不同病程中的表達情況及用于區(qū)分結核感染不同病程的可能性。并用ROC曲線驗證各指標用于區(qū)分結核活動性感染和潛伏性感染的診斷效益。
　　2.分別采集結核感染活動期（50例）、潛伏感染期（49例）以及健康對照人群(50例)外周靜脈抗凝全血，通過液態(tài)芯片技術同時檢測38種（EGF、FGF-2、Eot

7、axin、TGF-α、G-CSF、Fit-3L、GM-CSF、Fractalkine、IFN-α2、IFNγ、GRO、IL-10、MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、IL-13、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNF-α、TNF-β、VEGF

8、)與結核感染相關的免疫標志物，分析結核桿菌感染不同狀態(tài)下免疫標志物的表達情況，了解結核桿菌感染活動期、潛伏感染期的抗原結構、功能及表達情況，從而提高結核感染診斷的陽性率和發(fā)現(xiàn)新的診斷分子標志物。并用ROC曲線驗證各指標用于區(qū)分結核活動性感染和潛伏性感染的診斷效益。
　　結果：
　　1.結核活動期組Treg細胞和Th17細胞的比例明顯高于結核潛伏期組和正常對照組（Treg細胞:9.61±2.26％ VS6.31±1.44％和9

9、.61±2.26％ VS4.16±1.01％ P＜0.05;Th17細胞:3.08±0.80％ VS1.31±0.50％和3.08±0.80％VS1.15±0.46％ P＜0.05），結核潛伏期組Treg細胞的比例明顯高于正常對照組(6.31±1.44％ VS4.16±1.01％P＜0.05)，但結核潛伏期組Th17細胞的比例和正常對照組相比無明顯差異(1.31±0.50％ VS1.15±0.46％ P＞0.05)。結核活動期組IL-1

10、0和IL-17的表達量明顯高于結核潛伏期組和正常對照組(P＜0.05)，結核潛伏期組IL-10的表達量明顯高于正常對照組(P＜0.05)，但結核潛伏期組IL-17的表達量和正常對照組無明顯差異(P＞0.05)。Treg細胞和TH17細胞用于區(qū)分結核潛伏期和活動期的ROC曲線下面積分別為0.890和0.710。
　　2.通過對檢測的38種結核免疫標志物的分析發(fā)現(xiàn)，Eotaxin、IL-1α、IP-10、MCP-1、IL-10和TNF

11、-α在結核感染患者和健康對照人群間表達有明顯差異(P＜0.05)，MCP-1和IL-1α在結核活動期和潛伏期表達有明顯差異(P＜0.05)。MCP-1和IL-1α用于區(qū)分結核潛伏期和活動期的ROC曲線下面積分別為0.905和0.825。
　　結論：
　　1.Treg細胞和Th17細胞以及Eotaxin、IL-1α、IP-10、MCP-1、IL-10和TNF-α等細胞因子在結核感染患者中的表達量明顯高于健康對照人群(P＜0.0