PGE2對Treg-Th17細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)及對膠原誘導(dǎo)性小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病的影響.pdf

1、既往認(rèn)為T輔助細(xì)胞分為Th1（T help cell1）和Th2（T help cell2）型，最近研究發(fā)現(xiàn)初始T輔助細(xì)胞（Th0）至少可以分化為4種亞群，除Th1和Th2外，還有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th17（IL-17 producing T cell）細(xì)胞。Th0細(xì)胞在抗原呈遞細(xì)胞分泌的TGF-β作用下可分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），若同時存在TGF-β和IL-6則Th0分化為Th17細(xì)胞。Foxp3（foxhead box

2、 protein3）和RORγt（orphan nuclear receptor）分別是控制Th0向Treg和Th17分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞能夠介導(dǎo)前炎癥反應(yīng)，與自身免疫性疾病關(guān)系密切。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在阻止自身免疫反應(yīng)和維持機體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用。
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以慢性侵蝕性周圍關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，病因及發(fā)病機制尚不完全清楚。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠是目前公認(rèn)的研究RA較為理

3、想的動物模型。越來越多的研究表明Th17細(xì)胞和CD4+Treg細(xì)胞在RA發(fā)病中占有重要地位。各種免疫活性細(xì)胞參與RA發(fā)病，病程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡并產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，其中花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列腺素E2（PGE2）是相當(dāng)重要的致炎因子。動物實驗表明阻斷PGE2受體或敲除PGE2受體的CIA小鼠病情明顯緩解。PGE2的受體（EP1-4）分布廣泛，研究認(rèn)為PGE2具有明確的免疫調(diào)節(jié)作用。但其調(diào)控Th1/Th2平衡的作用存在爭議，認(rèn)為PGE2既有

4、促炎作用又有抗炎活性，多數(shù)研究表明PGE2抑制Th0向Th1分化而促進其向Th2方向分化。但PGE2對Treg和Th17分化的影響鮮有報道。
　　 基于上述研究認(rèn)為炎癥介質(zhì)PGE2可能對Treg/Th17細(xì)胞的分化具有調(diào)控作用，并可能通過此調(diào)節(jié)作用參與RA的發(fā)病過程。本課題在細(xì)胞水平以Th0作為靶細(xì)胞研究了PGE2對Treg和Th17細(xì)胞分化的影響及及其受體學(xué)機制，在整體水平應(yīng)用PGE2受體阻斷劑觀察對CIA小鼠病情的影響探討了

5、PGE2是否可通過影響Treg和Th17細(xì)胞分化而參與RA發(fā)病，以進一步揭示炎癥介質(zhì)PGE2在RA發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 1.PGE2受體在CD4+CD62L+naive T（Th0）細(xì)胞的表達
　　 本部分研究應(yīng)用MiniMACS系統(tǒng)，磁珠分選C57/BL6小鼠脾CD4+CD62L+（ThO）細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定純度。分選后的細(xì)胞分別加入抗EP1、EP2、EP3和EP4的多克隆抗體和熒光二抗，流式細(xì)胞儀檢測EP1-

6、4在Th0的表達，RT-PCR技術(shù)檢測EP1-4 mRNA在Th0的表達情況。結(jié)果顯示：（1）細(xì)胞經(jīng)磁珠分選后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD4+CD62L+細(xì)胞純度在90％以上。（2）經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，前列腺素E2的4個受體EP1、EP2、EP3、EP4在CD4+CD62L+naive T細(xì)胞上均有不同程度的表達，其中EP2表達最強，EP4表達最弱。（3）RT-PCR技術(shù)檢測到EP1、EP2、EP3、EP4mRNA在CD4+CD62L+naiv

7、e T細(xì)胞上均有表達。該結(jié)果為進一步研究PGE2對Th0分化的調(diào)節(jié)作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 2.PGE2對Th0向Treg和Th17細(xì)胞定向分化的調(diào)節(jié)作用及受體學(xué)途徑
　　 本部分研究應(yīng)用磁珠分選的Th0細(xì)胞，在抗CD3/CD28存在的條件下，TGF-β1作用72h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)（28.65±6.83）％細(xì)胞同時表達CD25和Foxp3；應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表

8、達，發(fā)現(xiàn)在36h達到高峰，說明成功誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。PGE2能劑量依賴性降低CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量，其中1μMPGE2作用最強，表明PGE2可明顯抑制Th0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化的數(shù)量。誘導(dǎo)Th0向Treg細(xì)胞分化，加入EP1-4受體的特異性激動劑（濃度均為10μM），研究PGE2產(chǎn)生上述作用的受體途徑，發(fā)現(xiàn)17-phenyl trinor PGE2（EP1激動劑）、sulprostone（EP3激動劑）對CD25+Fo

9、xp3+細(xì)胞數(shù)量無明顯影響，PGE1-alchol（EP4激動劑）部分模擬了PGE2降低CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量的作用，而butaprost（EP2激動劑）幾乎完全模擬了PGE2的上述作用。誘導(dǎo)Th0向Treg細(xì)胞分化，加入不同劑量的PGE2，36h后應(yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測Foxp3 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)PGE2劑量依賴性抑制了Foxp3 mRNA的表達，其中1μM PGE2作用最強，表明PGE2在mRNA水平可抑制Th

10、0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。誘導(dǎo)Th0向Treg細(xì)胞分化，加入EP1-4受體的激動劑（濃度均為10gM，研究PGE2產(chǎn)生上述作用的受體途徑，發(fā)現(xiàn)sulprostone對Foxp3 mRNA的表達無明顯影響，17-phenyl trinor PGE2和PGE1-alchol部分模擬了PGE2抑制Foxp3 mRNA表達的作用，而butaprost幾乎完全模擬了PGE2的上述作用。上述結(jié)果表明PGE2產(chǎn)生抑制Th0向Treg細(xì)胞方向分化的作用

11、，該作用可能通過EP2和EP4受體途徑介導(dǎo)。
　　 3.PGE2對CIA小鼠Treg/Th17細(xì)胞的影響
　　 選用雌性DBA/1小鼠50只，隨機分為空白對照組（6只）和CIA單純造模組（12只），AH6809（EP2受體阻斷劑）處理組（9只），L161982（EP4受體阻斷劑）處理組（9只），DMF溶劑對照組（7只），DMSO溶劑對照組（7只）。適應(yīng)環(huán)境3天后尾根部注射Ⅱ型膠原及完全弗氏佐劑的乳化劑100μl（含CⅡ2

12、00μg），d21后再次尾根部加強免疫。AH6809和L161982處理組分別給相應(yīng)的藥物，劑量均為5mg/Kg/d，從第二次CⅡ免疫后次日開始腹腔注射連續(xù)14天。溶劑對照組分別給予相應(yīng)的溶劑DMF+PBS和DMSO+PBS，注射方式相同。造模28天時分離CIA造模組小鼠的脾細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，1×106cell/孔種于24孔板，與CⅡ（50μg/ml）共同孵育，觀察PGE2及其受體激動劑、阻斷劑對Treg和Th17細(xì)胞的

13、影響。首次免疫后第35天觀察各組發(fā)病情況及關(guān)節(jié)病理改變，取各處理組脾及腹股溝引流淋巴結(jié)細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)以CD4+T細(xì)胞開窗測定CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，ELISA法測定血清IL-17含量觀察AH6809和L161982對CIA小鼠病情和Treg/Th17平衡的影響。
　　 結(jié)果表明:外源性PGE2能劑量依賴性降低造模28天分離的脾細(xì)胞CD25+Foxp3+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，其中1μM PG

14、E2作用最強。17-phenyl trinor PGE2、sulprostone對CD25+Foxp3+細(xì)胞比例無明顯影響，butaprost部分模擬了PGE2降低CD25+Foxp3+細(xì)胞比例的作用，AH6809未能拮抗外源性PGE2對CD25+Foxp3+細(xì)胞比例的影響。PGE1-alchol幾乎完全模擬了PGE2的上述作用，L161982對外源性PGE2降低CD25+Foxp3+細(xì)胞比例的作用產(chǎn)生了明顯的拮抗作用。上述結(jié)果表明外源

15、性PGE2抑制造模第28天CIA小鼠脾細(xì)胞CD4+Treg細(xì)胞的分化，此作用可能通過EP2和EP4受體介導(dǎo)。
　　 結(jié)論：本研究在細(xì)胞水平以Th0作為靶細(xì)胞研究了PGE2對Treg和Th17細(xì)胞分化的影響及及其受體學(xué)途徑，在整體水平應(yīng)用PGE2受體阻斷劑觀察對CIA小鼠病情和Treg/Th17細(xì)胞平衡的影響，得出以下結(jié)論：（1）小鼠脾來源的Th0細(xì)胞表面存在PGE2的四種受體亞型，其中EP2表達最強，EP4表達最弱。（2）細(xì)胞學(xué)

16、實驗表明PGE2抑制Th0向Treg細(xì)胞方向的分化；PGE2同樣抑制Th0向Th17細(xì)胞的分化，上述作用通過EP2和EP4受體介導(dǎo)。（3）外源性PGE2抑制造模28天分離的脾細(xì)胞中CD4+Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化，該作用主要通過EP4受體介導(dǎo)。（4）EP2受體阻斷劑和EP4受體阻斷劑對CIA發(fā)病率和起病時間無明顯影響，EP4受體阻斷劑明顯減輕CIA病情，但EP2受體阻斷劑對病情無明顯影響。（5）造模組小鼠脾和引流淋巴結(jié)中CD44

17、-Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，EP4受體阻斷劑明顯升高脾和引流淋巴結(jié)CD4+ Treg細(xì)胞數(shù)量，而EP2受體阻斷劑對此無明顯影響。造模組小鼠血清IL-17含量明顯增多，EP4受體阻斷劑明顯降低IL-17分泌量，而EP2受體阻斷劑對此無明顯影響。本研究表明PGE2對Treg/Th17分化具有明確的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞實驗顯示PGE2對Th0向Treg和Th17的分化均具有抑制作用，但動物實驗顯示內(nèi)源性PGE2通過EP4受體促進IL-17的產(chǎn)生同時