風(fēng)濕寧膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥、骨骼和軟骨破壞及滑膜組織增殖為特征的自身免疫性疾病。RA的發(fā)病機(jī)制不僅涉及T淋巴細(xì)胞活化，而且與機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)及線粒體功能失活參與調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程密切相關(guān)。近年來(lái)的研究表明活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)在RA的防治中發(fā)揮著重要的作用。在許多組織中，ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激破壞線粒體呼吸鏈，損傷線粒體并導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡。而對(duì)于

2、RA類(lèi)腫瘤樣增生的滑膜組織而言，誘導(dǎo)ROS表達(dá)或生物活性的發(fā)揮，能夠上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放，激活天冬氨酸特異的半胱氨酸酶(caspase)，誘導(dǎo)過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞走向凋亡，這無(wú)疑將成為遏制RA病情發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，有利于RA的防治。風(fēng)濕寧膠囊（以下簡(jiǎn)稱(chēng)風(fēng)濕寧，F(xiàn)SN）主要用于治療寒濕兼瘀血阻絡(luò)型痹癥，經(jīng)十余年臨床應(yīng)用證實(shí)其對(duì)RA療效顯著。前期已開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)SN具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，在

3、抗RA方面具有良好的應(yīng)用前景，但其發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚未明了，特別是其抗RA的機(jī)制是否與誘導(dǎo)過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞凋亡有關(guān)目前尚未明確。為此，我們針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了一系列研究，探討了FSN對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)及其促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理，結(jié)果顯示，F(xiàn)SN可調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌和恢復(fù)Th1/Th2、CD4+/CD8+平衡，而且能夠通過(guò)升高體內(nèi)活性氧的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)過(guò)度增殖的滑膜細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑實(shí)現(xiàn)凋亡，而后者很可能是FSN抗RA的一個(gè)新機(jī)制

4、。
　　 目的:以牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠為模型，從CIA大鼠的足腫脹度、關(guān)節(jié)指數(shù)、病理組織形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞因子、T淋巴細(xì)胞亞群等方面考察FSN的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，闡明其可能的分子機(jī)制。觀察風(fēng)濕寧膠囊對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞是否具有促凋亡作用并從活性氧的生成、線粒體功能、Bcl-2、caspase等角度探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:大鼠足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑誘發(fā)CIA模型;以FSN0.33、0.66、1.32 g·kg

5、-1ig給藥，持續(xù)30d，0.03g·kg-1雷公藤多苷為陽(yáng)性對(duì)照。采用足容積法測(cè)量足腫脹度;利用關(guān)節(jié)炎指數(shù)對(duì)大鼠關(guān)節(jié)損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià);稱(chēng)重法測(cè)定大鼠體重、脾、胸腺的重量;光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化;拍攝關(guān)節(jié)X線片;ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1、IFN-γ、IL-4、IL-10含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群水平。透射電鏡下觀察大鼠滑膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);Fe2++H2O2系統(tǒng)檢測(cè)羥自由基含量;紫外分光光度法檢測(cè)滑膜A

6、TP含量、caspase-3、caspase-9活性;ELISA法檢測(cè)滑膜上清液中Cytc的水平;免疫組化法檢測(cè)滑膜組織VEGF、Bcl-2、Bax的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9mRNA的表達(dá)水平;Bradford蛋白濃度法測(cè)定滑膜蛋白的濃度;Western blot法檢測(cè)滑膜caspase-3、caspase-9p35、VDAC1、AIF蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1

7、、FSN對(duì)CIA大鼠具有治療作用，其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用與降低Th1細(xì)胞分泌的IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子水平，升高Th2細(xì)胞分泌的抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量及恢復(fù)CD4+/CD8+平衡密切相關(guān)。此外，在血管微環(huán)境方面，證實(shí)了CIA大鼠高表達(dá)的VEGF蛋白在FSN用藥干預(yù)后表現(xiàn)出不同程度地降低趨勢(shì)，血管翳的形成和滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)得到抑制。
　　 FSN(0.66、1.32 g·kg-1)能夠明顯抑制CIA

8、大鼠足腫脹、減輕關(guān)節(jié)疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等癥狀，減緩CIA大鼠體重的下降;光鏡下觀察到關(guān)節(jié)滑膜組織輕度增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜組織新生血管減少、血管翳減輕、偶見(jiàn)少量纖維增生、骨及軟骨受損程度減輕;FSN能夠不同程度地下調(diào)Th1細(xì)胞分泌的IL-1、TNF-α、IFN-γ水平，上調(diào)Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10水平，并降低CIA大鼠的胸腺指數(shù);流式結(jié)果也表明，F(xiàn)SN能恢復(fù)CIA大鼠CD4+/CD8+比值，降低CD4+T淋巴細(xì)胞的

9、水平。
　　 2、FSN上調(diào)CIA大鼠滑膜組織ROS的表達(dá)CIA大鼠滑膜組織中ROS含量降低，F(xiàn)SN給藥(0.33、0.66、1.32 g·kg-1，ig，d30)后ROS的表達(dá)增高，而FSN升高CIA大鼠ROS水平是其調(diào)節(jié)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放、滑膜細(xì)胞內(nèi)ATP水平及線粒體跨膜電位、影響滑膜細(xì)胞凋亡進(jìn)程、抑制免疫亢進(jìn)、發(fā)揮其治療作用的特點(diǎn)之一。
　　 3、FSN通過(guò)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡FSN體內(nèi)給藥后CI

10、A大鼠滑膜細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常且能夠抑制間質(zhì)膠原纖維的異常增生，改善線粒體的腫脹或空泡變性狀態(tài);Western-blot結(jié)果顯示，F(xiàn)SN可促進(jìn)VDAC1蛋白表達(dá)量升高;紫外分光光度法結(jié)果表明FSN用藥組的ATP含量顯著降低;而在滑膜組織勻漿的上清液中檢測(cè)到FSN（0.66 g·kg-1）的Cytc釋放量明顯增多;免疫組化結(jié)果表明，隨著劑量的增大，F(xiàn)SN給藥組滑膜細(xì)胞的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)逐漸減少，呈下降趨勢(shì)，Bax陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)明顯增多;

11、經(jīng)RT-PCR、Western-blot證實(shí)，F(xiàn)SN干預(yù)后的CIA滑膜組織中，caspase-3、caspase-9p35、AIF的表達(dá)明顯上調(diào);caspase酶活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，caspase-3、caspase-9活性在FSN給藥前后有顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、FSN對(duì)CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥具有明顯的改善作用。FSN抑制CIA大鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IFN-γ的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子I

12、L-4、IL-6、IL-10的生成，降低CD4+/CD8+及抑制VEGF蛋白表達(dá)，是其發(fā)揮調(diào)節(jié)CIA大鼠亢進(jìn)的免疫功能效應(yīng)的關(guān)鍵。
　　 2、FSN通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的生成影響滑膜線粒體功能及Th細(xì)胞的分化，促進(jìn)經(jīng)caspase依賴(lài)性途徑、AIF途徑的細(xì)胞凋亡，抑制滑膜的過(guò)度增殖，從而發(fā)揮其治療作用。
　　 3、線粒體功能改變導(dǎo)致滑膜細(xì)胞凋亡參與了FSN防治RA的病理生理改變，表現(xiàn)為:線粒體在ROS的刺激下，促進(jìn)VDAC

13、1通道開(kāi)放，影響MPTP的開(kāi)放及ATP等能量物質(zhì)的逸出，造成線粒體呼吸鏈抑制、膜電位喪失，釋放Cytc和AIF，引發(fā)細(xì)胞凋亡的兩條途徑:一條需要Bcl-2家族和caspase酶依賴(lài)性參與，激活caspase-9和下游的caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另一條是需要AIF調(diào)節(jié)的多聚聚合酶途徑的參與。在這一過(guò)程中，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax蛋白通過(guò)與VDAC1的結(jié)合，調(diào)節(jié)凋亡進(jìn)程。因此，線粒體功能改變可能在滑膜細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重