人臍帶間充質干細胞微泡對膠原誘導關節(jié)炎大鼠Treg-Th17及相關炎癥因子的影響.pdf

1、背景：
　　類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病機制尚不清楚，T細胞及其亞群成為介導其致病過程的主要炎癥細胞，Treg/Th17失衡和疾病的發(fā)生發(fā)展與轉歸密切相關。間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可通過平衡Treg/Th17失衡發(fā)揮免疫調節(jié)作用，微泡（Microvesicles, MVs）是MSCs在靜息或應激狀態(tài)下產生的膜分泌體系，含有豐富的生物學信息。目前已

2、證實，其能模擬其母體細胞的免疫調節(jié)及組織修復作用，可能成為RA治療的新手段。
　　目的：
　　通過對RA動物模型即膠原誘導關節(jié)炎(Collagen-Induced Arthritis,CIA)大鼠的體內實驗研究，觀察hUCMSC-MVs干預對CIA大鼠關節(jié)炎癥狀、影像學及病理變化的影響，對血清中促炎因子IL-17、抑炎因子TGF-β，脾臟T淋巴細胞增殖及凋亡指數，Treg/Th17,Treg細胞特異性轉錄調節(jié)因子FoxP3，

3、Th17細胞特異性轉錄因子ROR-γT的調節(jié)作用，探討其療效及作用機制。
　　方法：
　　1. hUCMSC-MVs的分離及鑒定：對hUCMSCs“饑餓”培養(yǎng)24小時，差速離心法提取上清液中的微泡，使用透射電鏡觀察其形態(tài)，并使用 Nano Drop2000超微量分光光度計測定其蛋白質含量。
　　2.建立CIA模型：弗氏完全佐劑+II型膠原多點皮下注射免疫雌性Wistar大鼠，兩周后腹腔注射再次建立CIA大鼠模型。大鼠隨

4、機分為以下7組，每組6只，即CIA模型組，hUCMSCs組，hUCMSC-MVs低、中及高濃度組，同時設立MTX組及正常對照組。
　　3.給藥方法：再次免疫后次日進行干預。hUCMSCs尾靜脈移植2×106/kg/鼠， hUCMSC-MVs分別尾靜脈注射30ug/100μl、60ug/100μl及90ug/100μl/鼠，對照組給予等量的生理鹽水，MTX組給予MTX0.9mg/kg/w腹腔注射。
　　4.檢測指標：初次免疫后

5、每周對各組大鼠體重、關節(jié)炎指數和后足腫脹度進行測定，42天時，留取后足影像學資料、外周血、脾臟及后足踝關節(jié)，流式多因子檢測技術檢測血清中IL-17、TGF-β的表達水平，流式細胞術檢測脾臟T細胞增殖及凋亡指數，Treg、Th17細胞水平；同時對各組脾臟及關節(jié)組織制作病理切片，觀察關節(jié)病理變化；免疫組織化學技術觀察脾臟的Fox-P3及ROR-γT的表達情況，收集數據做統(tǒng)計分析。
　　結果：
　　1. hUCMSC-MVs的鑒定

6、及對膠原誘導關節(jié)炎大鼠一般情況的影響
　?。?）hUCMSC-MVs的鑒定透射電鏡觀察，MVs為一類直徑介于30nm-200nm之間大小不一的囊泡狀結構，蛋白質濃度約為2.05μg/μl，符合目前國際公認的鑒定MSC-MVs的標準。
　　（2）hUCMSC-MVs對CIA大鼠體重的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠體重增長程度明顯降低（P<0.05），干預后有所改善，hUCMSC-MVs高濃度組有統(tǒng)計學差異（P<0.05

7、），且高于低濃度組（P<0.05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠關節(jié)炎癥狀的影響 CIA模型組大鼠后足較正常對照組腫脹明顯（P<0.05），關節(jié)炎指數明顯升高（P<0.05）。各干預組后足腫脹有所減輕，關節(jié)炎指數下降，42天時僅MTX組有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠踝關節(jié)影像學的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠關節(jié)X線表現為關節(jié)間隙模糊，甚至狹窄，出現骨髓疏松

8、，加強免疫后可見踝關節(jié)有蟲蝕樣破壞。干預后關節(jié)破壞有所修復，關節(jié)間隙及骨質疏松較前有所減輕，且高濃度組療效明顯，與hUCMSCs組及MTX組接近。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠踝關節(jié)病理的影響健康對照組大鼠關節(jié)腔結構清晰，無或少量滑膜增生及炎性細胞浸潤；CIA模型組滑膜增生明顯，大量炎性細胞浸潤，部分出現軟骨破壞。各干預組滑膜增生及炎性細胞浸潤明顯減少，且高濃度組優(yōu)于hUCMSCs及MTX組。
　　2. hUC

9、MSC-MVs對膠原誘導關節(jié)炎大鼠Treg/Th17及炎癥因子的影響
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠血清IL-17及TGF-β等炎癥因子的影響 CIA模型組IL-17水平較正常對照組明顯升高（P<0.05）,TGF-β水平有所下降。hUCMSC-MVs高濃度組IL-17水平與hUCMSCs及MTX組接近（P>0.05），明顯低于低中濃度組（P<0.05）。中高濃度組、hUCMSCs及MTX組TGF-β水平接近（P<0.

10、05）。
　　（2）hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟T淋巴細胞的影響 CIA模型組T淋巴細胞增殖水平高于正常對照組(P<0.05）；高濃度組與hUCMSCs組接近，高于MTX組（P<0.05）。CIA模型組T淋巴細胞凋亡水平明顯降低（P<0.05）；各干預組均有所下降，且高濃度組、hUCMSCs及MTX組水平接近（P>0.05）。
　?。?） hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞

11、、Th17細胞及Treg/Th17的影響與正常對照組比較，CIA模型組大鼠脾臟Th17細胞水平明顯升高（P<0.05），Treg/Th17明顯降低（P<0.05），而CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞水平有所降低，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。各干預組Th17細胞水平均明顯降低， Treg/Th17升高（P<0.05），中高濃度組對Th17細胞及Treg/Th17的調節(jié)能力與MTX組接近，優(yōu)于低濃度組（P<0.05），且高濃度

12、組抑制Th17細胞的能力優(yōu)于hUCMSCs組（P<0.05）。hUCMSC-MVs高濃度組上調CD4+CD25+FoxP3+Treg水平的能力與hUCMSCs、MTX組接近（P>0.05），優(yōu)于低、中濃度組（P<0.05）。
　?。?）hUCMSC-MVs對CIA大鼠脾臟Foxp3及ROR-γT表達的影響 CIA大鼠脾臟ROR-γT的表達較正常對照組明顯升高（P<0.05），FoxP3水平明顯下降（P<0.05）。經hUCMSC-

13、MVs干預后，ROR-γT表達明顯降低，FoxP3水平升高（P<0.05），且高濃度組優(yōu)于低中濃度組（P<0.05）。在調節(jié)轉錄因子ROR-γT方面，hUCMSC-MVs高濃度組與hUCMSCs組接近（P>0.05），優(yōu)于MTX組（P<0.05）；而在調節(jié)FoxP3方面，hUCMSC-MVs高濃度組均優(yōu)于hUCMSCs及MTX組（P<0.05）。
　　結論：
　　1. hUCMSC-MVs明顯改善CIA大鼠體重減輕，抑制關節(jié)

14、滑膜增生及炎癥細胞浸潤，發(fā)揮抗炎及組織修復作用。
　　2. hUCMSC-MVs通過抑制CIA大鼠脾臟T淋巴細胞增殖、促進凋亡，上調CD4+CD25+FoxP3+Treg水平，下調Th17細胞水平，平衡Treg/Th17比例發(fā)揮免疫調節(jié)作用，高濃度組不弱于hUCMSCs組，甚至在下調Th17方面更有優(yōu)勢；除對T細胞增殖的抑制作用弱于MTX組，余作用與其相當。
　　3. hUCMSC-MVs抑制CIA大鼠脾臟ROR-γT，促進