異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過下調(diào)Th17細(xì)胞治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是系統(tǒng)性的自身免疫病，對稱小關(guān)節(jié)滑膜炎為其主要病理改變、繼而發(fā)生軟骨和骨的破壞，導(dǎo)致殘疾，危害性極大。國內(nèi)報(bào)道RA的發(fā)病率為0.34％，總計(jì)患病人數(shù)超過500萬，因治療效果不好每年用于治療的直間接損失很大，因此積極早期治療，改善預(yù)后，降低致殘率是目前的治療趨勢?，F(xiàn)階段RA的治療原則是改變病情抗風(fēng)濕藥物的早期聯(lián)合應(yīng)用，國外報(bào)道臨床緩解率僅能達(dá)到40-47％

2、[1]。RA的發(fā)病機(jī)制雖仍然不明確，但目前公認(rèn)T、B淋巴細(xì)胞的異常在RA的疾病發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[2-4]。隨著對疾病的認(rèn)識(shí)和分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)的提高，Th細(xì)胞的異?；罨徽J(rèn)為是疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，因此免疫功能的調(diào)控和平衡是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎新的思路。Th1/Th2平衡破壞被認(rèn)為是RA發(fā)病的機(jī)制，其中Th1細(xì)胞與炎癥的發(fā)生有關(guān)，而Th2細(xì)胞有對抗炎癥的作用[8]。但隨著對Th細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入發(fā)現(xiàn)：免疫反應(yīng)中關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞是T

3、h亞群中新近發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞，其產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子IL-17具有強(qiáng)大的致炎作用，導(dǎo)致并維持了RA的發(fā)生和發(fā)展，提示Th17細(xì)胞在RA的發(fā)病過程中同Th1細(xì)胞一樣也起著關(guān)鍵的炎癥發(fā)生和維持作用。Th17細(xì)胞發(fā)揮致炎作用主要是通過分泌細(xì)胞因子的形式。細(xì)胞因子再通過作用于不同的靶細(xì)胞，形成復(fù)雜的炎癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步激發(fā)和促進(jìn)了RA的發(fā)生及發(fā)展，這就為RA的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。針對免疫系統(tǒng)的調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchyma

4、lStemCells，MSCs)不僅有再生功能，還有免疫調(diào)節(jié)的作用，已開始嘗試應(yīng)用于難治性自身免疫性疾病的治療。比如間充質(zhì)干細(xì)胞治療器官移植并發(fā)癥移植物抗宿主病取得了可喜的療效，引起了公眾的注意，繼而應(yīng)用到了腎小球腎炎、自身免疫性腦脊髓膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及多發(fā)性硬化癥等多種自身免疫病的治療中，并取得了較有效的療效，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞在骨科再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也為RA患者機(jī)體免疫功能紊亂的調(diào)控，以及受損關(guān)節(jié)的修復(fù)帶來了新的機(jī)遇。
　　

5、 [目的]
　　 采用貼壁方法從整條臍帶中分離MSCs，通過傳代純化細(xì)胞，檢測其表型，并觀察其成骨分化能力；觀察動(dòng)物模型體內(nèi)MSCs移植后，對體內(nèi)Th17細(xì)胞表達(dá)水平及分泌細(xì)胞因子水平的變化，探討其在體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的可能機(jī)制；在分子水平闡明MSCs通過Th17細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫紊亂的可能機(jī)制。觀察體外UC-MSCs與RA患者外周血PBMC不同濃度梯度的混合細(xì)胞培養(yǎng)后，Th17細(xì)胞表達(dá)水平及相關(guān)細(xì)胞因子的變化；
　　 [

6、方法]
　　 第一部分：采用貼壁培養(yǎng)法體外分離、培養(yǎng)臍帶MSCs，同時(shí)行細(xì)胞表型及骨分化能力鑒定。
　　 第二部分：膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎異基因臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)移植治療大鼠模型，觀察MSCs對Th17細(xì)胞表達(dá)水平的可能的調(diào)控作用機(jī)制研究：弗氏完全佐劑加Ⅱ型膠原混合劑2周內(nèi)2次免疫動(dòng)物，建立CIA模型；造模成功大鼠隨機(jī)分為MSCs治療組（單次治療組和多次治療組），甲氨碟呤治療組和CIA對照組，同時(shí)設(shè)立正常對照組每組12只；

7、采用尾靜脈注射MSCs移植途徑，每只大鼠MSCs移植的細(xì)胞數(shù)為1x106/kg;對照組以同樣方法注射等容量的生理鹽水，甲氨碟呤治療組每周給予5mg/kgMTX灌胃治療。每周觀察各組大鼠的關(guān)節(jié)癥狀，留取靜脈血，并進(jìn)行足容積的測定和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的評估。MSCs移植后第21,42天分兩批處死動(dòng)物取脾和關(guān)節(jié)滑膜組織，通過Realtime-PCR測定ROR-γtmRNA表達(dá)水平；Western-bloting測定脾臟ROR-γt的蛋白分泌水平的變化

8、，ELISA測定外周血IL-17，IL-21和IL-23的表達(dá)水平；收集數(shù)據(jù)并做統(tǒng)計(jì)分析。
　　 第三部分：觀察異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞混合培養(yǎng)后對Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子表達(dá)水平的研究。
　　 [結(jié)果]
　　 1.臍帶MSCs呈比較均一的，平行方向排列的，長梭形的成纖維細(xì)胞樣生長，其貼壁能力和增殖能力強(qiáng)，生長曲線呈S型；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表型顯示CD45陰性、CD44、CD

9、29陽性、CD71弱陽性；向骨分化能力強(qiáng)。符合間充質(zhì)干細(xì)胞的國際標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.MSCs治療組大鼠AI，雙后肢足容積均較CIA對照組大鼠明顯改善(P＜0.05)，MSCs多次治療組與單次治療組大鼠AI和后肢足容積比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；滑膜IL-17水平，在CIA對照組高于正常組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，MSCs多次治療組比單次治療組有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MSCs治療組與

10、MTX治療組IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；脾臟組織ROR-γt的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平CIA對照組比正常組和治療組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；脾臟組織ROR-γt的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平在MSCs多次治療組與MTX治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.異基因臍帶MSCs體外與RA患者PBMC混合培養(yǎng)3天。在DAS28＞5.1的RA患者組，MSCs可明顯降低Th7

11、細(xì)胞及因子的表達(dá)，降低ROR-γt的表達(dá)，減少血清中IL-17的含量，且與劑量有較好的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.MSCs呈比較均一的，沿一定方向排列的，梭形的成纖維細(xì)胞樣生長，貼壁能力和增殖能力強(qiáng)，骨分化能力強(qiáng)。流式細(xì)胞細(xì)胞表型測定顯示CD45陰性CD44CD29陽性CD71弱陽性。
　　 2.臍帶源MSCs移植明顯改善CIA大鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥狀和滑膜病理，并能下調(diào)實(shí)驗(yàn)