異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的初步探討.pdf

1、目的：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種慢性、系統(tǒng)性的炎性自身免疫病，通常伴有多關(guān)節(jié)腫脹與疼痛，若不及時(shí)治療，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、骨的侵蝕與破壞。盡管發(fā)病機(jī)制尚不明確，眾多證據(jù)表明T細(xì)胞、B細(xì)胞以及多種炎性因子在RA病理過程中均發(fā)揮著重要的作用。有效的抑制這些炎性因素，則成為了RA治療的一個(gè)重要目標(biāo)。近來，以T細(xì)胞、B細(xì)胞和各種炎性細(xì)胞因子為治療靶向的生物制劑已證實(shí)在RA治療中的具有顯著效果，但對(duì)

2、于一些難治性RA患者的治療仍不理想。而有學(xué)者認(rèn)為RA患者自身的干細(xì)胞本身就存在功能缺陷，使得目前采用自體干細(xì)胞移植來治療難治性RA的方案也受到質(zhì)疑。另一方面，RA患者關(guān)節(jié)局部持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致滑膜“腫瘤樣”增殖，以及軟骨組織最終遭受侵襲破壞的主要原因。盡管RA的治療在抑制系統(tǒng)性炎癥方面已有很大進(jìn)展，但在炎癥因素眾多的關(guān)節(jié)局部如何有效地修復(fù)受損的軟骨組織，目前還少見報(bào)道。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesen

3、chymalstem cells，BMSCs）多能分化性以及低免疫原性和免疫抑制特性的發(fā)現(xiàn)為解決這些問題帶來了希望。以BMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨已經(jīng)在治療骨關(guān)節(jié)炎（ostarthritis，OA）患者受損的關(guān)節(jié)軟骨方面取得了滿意的效果。另一方面，采用異體BMSCs治療(graft-versus-hostdiseases，GVHD)的臨床試驗(yàn)也取得成功。此外，BMSCs還被觀察到能夠緩解實(shí)驗(yàn)性腦脊膜炎（experiment a

4、lallergicencephalomyelitis，EAE）——一種自身免疫病的動(dòng)物模型的癥狀。然而，目前利用BMSCs的多能分化性和免疫學(xué)特性來治療RA還少見報(bào)道。
　　因此，本研究旨在BMSCs分離、培養(yǎng)以及體內(nèi)、外誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞/組織分化的基礎(chǔ)上：1.研究BMSCs對(duì)RA患者II型膠原（typeII collagean，CII）特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞的免疫抑制作用，并進(jìn)一步觀察異體BMSCs靜脈移植對(duì)膠原誘導(dǎo)（collag

5、en induced arthritis，CIA）大鼠模型的治療作用；2.初步研究BMSCs分化后的軟骨細(xì)胞的免疫學(xué)特性，探討以BMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨，在炎性因素眾多的關(guān)節(jié)內(nèi)修復(fù)受損軟骨同時(shí)是否可發(fā)揮抑炎作用，從而防止修復(fù)后軟骨再次遭受炎癥破壞的可能性；為臨床采用BMSCs治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法(分五部分)：
　　1.建立BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定體系和研究生物特性抽取正常健康供者骨髓3-5ml，

6、依次采用密度梯度離心法、自然貼壁法分離BMSCs；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞/脂肪細(xì)胞分化等方法對(duì)其鑒定；觀察不同代數(shù)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、衰老染色等各方面的變化以及長(zhǎng)期培養(yǎng)的BMSCs的自然分化情況，了解BMSCs的體外生長(zhǎng)以及部分生物學(xué)特性；通過透射電鏡觀察BMSCs的微觀結(jié)構(gòu)。
　　2.建立體內(nèi)、外BMSCs向軟骨細(xì)胞分化和鑒定體系將BMSCs離心后形成微小細(xì)胞團(tuán)，在TGF-β1、地塞米松（Dex）

7、及維生素C(VitC)等誘導(dǎo)下向軟骨細(xì)胞分化。21d后，細(xì)胞團(tuán)經(jīng)石蠟包埋、切片及HE染色后，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色及CoII的免疫組化染色。采用Westernblot和RT-PCR，分別檢測(cè)誘導(dǎo)前后BMSCs中CoII及前CoIImRNA的表達(dá)。同時(shí)，采用組織工程技術(shù)在體外構(gòu)建BMSCs-CII海綿復(fù)合物，在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)1周后移植入裸鼠皮下，8w后觀察其大體形態(tài)。
　　3.研究BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞對(duì)CII反應(yīng)性T細(xì)胞的作

8、用收集RA患者外周血（peripheralblood，PB）及關(guān)節(jié)滑液（synovialfluids，SF），分離單個(gè)核細(xì)胞（mononuclearcell，PBMC和SFMC）。采用3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法觀察BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞對(duì)RA患者CII特異性T細(xì)胞在增殖、CD25/CD29等表面活化標(biāo)記表達(dá)、多種細(xì)胞因子分泌（IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α和TGF-β1）、T

9、細(xì)胞亞群變化以及T細(xì)胞凋亡等各方面的作用；探討TGF-β1在BMSCs及其誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞抑制T細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　4.研究BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞對(duì)CII反應(yīng)性B細(xì)胞的作用收集RA患者PB及SF，分離PBMC和SFMC。采用BrdU摻入法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法觀察BMSCs及其分化的軟細(xì)胞對(duì)RA患者CII特異性B細(xì)胞在增殖、亞群變化、抗CII抗體表達(dá)以及B細(xì)胞凋亡等各方面的作用；探討TGF-β1在BMSCs及其誘導(dǎo)的

10、軟骨細(xì)胞抑制B細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　5.研究異體BMSCs治療大鼠CIA采用SD大鼠尾根部皮內(nèi)注射乳化的雞CII與完全福氏佐劑（completeFreund’sadjuvant，CFA）混合物的方法，建立CIA大鼠模型；分離、培養(yǎng)健康SD大鼠BMSCs；按靜脈給予BMSCs的時(shí)間不同，將CIA大鼠分為初次免疫第7d和21d兩個(gè)治療組。以未注射BMSCs組CIA大鼠作陽性對(duì)照，通過CIA模型關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎評(píng)分，血清中抗CII抗體水平變化

11、以及關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)檢查，觀察靜脈注射異體BMSCs對(duì)CIA大鼠治療的效果。
　　結(jié)果:
　　1.BMSCs及其生物學(xué)特性分離的細(xì)胞呈成纖維樣的形態(tài)，其表面表達(dá)多種抗原標(biāo)志，但并不表達(dá)造血細(xì)胞系的抗原，且這群細(xì)胞具有成功的向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力，證實(shí)我們所分離出的細(xì)胞為BMSCs；傳至第2-3代時(shí)，無論細(xì)胞形態(tài)還是其表面抗原的表達(dá)均顯示BMSCs高度均一，但BMSCs隨著傳代呈逐漸衰老的趨勢(shì)；長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，BMSCs可

12、自發(fā)的向成骨細(xì)胞分化；透射電鏡下觀察，可見BMSCs具有成熟和幼稚兩種細(xì)胞形態(tài)。
　　2.BMSC向軟骨細(xì)胞分化體外誘導(dǎo)分化21d后HE染色顯示，細(xì)胞呈軟骨樣細(xì)胞形態(tài)；胞外基質(zhì)甲苯胺藍(lán)及CII染色呈陽性；誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)CII蛋白和前CoII的mRNA；此外，8w后觀察到裸鼠皮下植入的BMSCs-CII生物支架復(fù)合物已呈透明軟骨樣組織形態(tài)。
　　3.BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞對(duì)CII反應(yīng)性T細(xì)胞的作用BMSCs及其分化的軟骨

13、細(xì)胞，不引起RA患者T細(xì)胞的增殖與活化，反而能夠抑制CII特異性T細(xì)胞的增殖、活化抗原（CD25和CD29）的表達(dá)，并呈劑量依賴趨勢(shì)，且抑制效應(yīng)并不因?yàn)锽MSCs及其誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的延遲加入而改變；BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞同樣能夠顯著抑制CII特異性T細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子如IL-17A、IFN-γ、TNF-α（P<0.05），防止抗炎因子IL-4的降低（P<0.05）以及升高共培養(yǎng)體系中抗炎因子IL-10和TGF-β1的水平（P<0

14、.05）；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞顯著抑制T細(xì)胞亞群Th1、Th17的升高（P<0.05），防止Th2亞群降低；但對(duì)于Treg細(xì)胞的上調(diào)作用卻不顯著（P>0.05）；此外，BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的同時(shí)并不會(huì)造成T細(xì)胞凋亡；TGF-β1在BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞抑制T細(xì)胞的作用中扮演重要的角色。
　　4.BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞對(duì)CII反應(yīng)性B細(xì)胞的作用BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞，同樣

15、不引起RA患者B細(xì)胞的增殖，而對(duì)CII特異性B細(xì)胞的增殖具有抑制作用；BMSCs及其分化的軟骨能顯著抑制幼稚型CD27-IgG+B細(xì)胞比例的降低（P<0.05）和記憶型CD27+IgG+B細(xì)胞（non-swichedmemoryBcells）比例的升高（P<0.05），但對(duì)于記憶型CD27+IgD-B細(xì)胞（memoryBcells）比例的增長(zhǎng)，抑制作用卻并不顯著（P>0.05）；BMSCs同樣可顯著抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗CII抗體（P<0.0

16、5）；BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞發(fā)揮抑制作用時(shí)的同樣并不會(huì)引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡；TGF-β1在BMSCs及其分化的軟骨細(xì)胞抑制B細(xì)胞的作用中也發(fā)揮重要的作用。
　　5.異體BMSCs治療大鼠CIA的效果靜脈給予CIA大鼠異體BMSCs并不會(huì)導(dǎo)致大鼠死亡，反而能夠顯著緩解CIA的病程發(fā)展(即關(guān)節(jié)腫脹變化過程)（P<0.05）以及顯著降低CIA大鼠血清中抗CII抗體的水平（P<0.05）；關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查證實(shí)，BMSCs能顯著緩解CIA