miR-21-5p靶向作用喉癌候選抑瘤基因LCRG1對(duì)Hep2細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的研究.pdf

1、[目的]確定miR-21-5p與LCRG1的作用位點(diǎn)，研究miR-21-5p通過靶向調(diào)控喉癌候選抑瘤基因LCRG1參與喉癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。
　　[方法]前期實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) miR-21-5p與 LCRG1有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)miR-21-5p與LCRG13’UTR的結(jié)合位點(diǎn)來構(gòu)建其野生型和突變體載體，使相應(yīng)的miRNA種子區(qū)與LCRG13’UTR不能夠互補(bǔ)結(jié)合，測(cè)定LCRG13’UTR熒光素酶的活性，運(yùn)用突變體實(shí)驗(yàn)確定其結(jié)合位點(diǎn)

2、；將miR-21-5p mimic和miR-21-5p inhibitor瞬轉(zhuǎn)入Hep2細(xì)胞，RT-PCR驗(yàn)證miR-21-5p的表達(dá)情況后，利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LCRG1蛋白在瞬轉(zhuǎn)后喉癌細(xì)胞系Hep2中的表達(dá)情況。采用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)，觀察miR-21-5p靶向調(diào)控LCRG1的表達(dá)對(duì)Hep2細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。
　　[結(jié)果]1.miR-21-5p與LCRG13’UTR的第一個(gè)

3、結(jié)合位點(diǎn)的野生型能使熒光素酶的活性顯著性降低（P<0.05），突變體無顯著性降低，而第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的野生型和突變體均使熒光素酶的活性顯著性降低（P<0.05），表明第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)為其結(jié)合位點(diǎn)。2.瞬轉(zhuǎn) miR-21-5p mimic后，RT-PCR檢測(cè)顯示miR-21-5p的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），而瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p inhibitor后，miR-21-5p的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），說明瞬轉(zhuǎn)成功。3.上調(diào)miR-21-

4、5p可抑制LCRG1蛋白水平的表達(dá)，而下調(diào)miR-21-5p可促進(jìn)LCRG1蛋白水平的表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p mimic后，miR-21-5p mimic實(shí)驗(yàn)組較mimic NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，LCRG1的蛋白水平明顯降低（P<0.05）；而瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p inhibitor后，miR-21-5p inhibitor實(shí)驗(yàn)組較inhibitor NC對(duì)照組和Hep2

5、細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，LCRG1的蛋白水平明顯升高（P<0.05）。4.上調(diào)miR-21-5p抑制LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力增強(qiáng)，而下調(diào)miR-21-5p促進(jìn)LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力減弱。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：瞬轉(zhuǎn) miR-21-5p mimic后，miR-21-5p mimic實(shí)驗(yàn)組較mimic NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，生長(zhǎng)速度均明顯升高（P<0.05），表明上調(diào) miR-

6、21-5p抑制LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)；而瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p inhibitor后，miR-21-5p inhibitor實(shí)驗(yàn)組較inhibitor NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，生長(zhǎng)速度均明顯降低（P<0.05），表明下調(diào)miR-21-5p促進(jìn)LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的增殖能力減弱。劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p mimic后，miR-21-5p mimic實(shí)驗(yàn)組較m

7、imic NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，遷移及侵襲能力均明顯升高（P<0.05），表明上調(diào)miR-21-5p抑制LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的遷移及侵襲能力增強(qiáng)；而瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p inhibitor后，miR-21-5p inhibitor實(shí)驗(yàn)組較inhibitor NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，遷移及侵襲能力均明顯降低（P<0.05），表明下調(diào)miR-21-5p促進(jìn)LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的遷移及侵襲能

8、力減弱。另流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：瞬轉(zhuǎn)miR-21-5p inhibitor后，miR-21-5p inhibitor實(shí)驗(yàn)組較inhibitor NC對(duì)照組和Hep2細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組相比，G1期細(xì)胞百分比明顯升高，且細(xì)胞凋亡率明顯增高，表明下調(diào)miR-21-5p促進(jìn)LCRG1的表達(dá)使Hep2細(xì)胞的凋亡能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期主要阻滯于G1期。
　　[結(jié)論]在Hep2細(xì)胞中miR-21-5p能抑制喉癌候選抑瘤基因LCRG1的表達(dá)，并使Hep2細(xì)胞