miR-21-5p對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)-血管單元修復(fù)的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）致殘、致死率高，其所致的繼發(fā)性腦損傷與TBI預(yù)后密切相關(guān)。神經(jīng)-血管單元（NVU）是由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的功能單元，通過(guò)其中各種成分的相互作用維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。促進(jìn)TBI后NVU損傷修復(fù)是治療繼發(fā)性腦損傷、救治TBI的關(guān)鍵。
　　miRNAs在TBI領(lǐng)域中的研究報(bào)道尚少。我所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，TBI大鼠創(chuàng)傷側(cè)大腦皮層miR-21-5p表達(dá)量較

2、傷前明顯升高。此外，初步證實(shí)miR-21-5p表達(dá)水平的升高可以減輕腦組織細(xì)胞凋亡，并改善TBI大鼠的神經(jīng)功能預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明miR-21-5p在NVU損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制，為探索TBI后miRNAs治療的新策略提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用qRT-PCR及miRNA原位雜交+免疫熒光雙染技術(shù)，檢測(cè)TBI后miR-21-5p在創(chuàng)傷灶腦組織的表達(dá)變化，及其在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及腦

3、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的原位表達(dá)變化。
　　2.通過(guò)改進(jìn)的神經(jīng)功能評(píng)分及水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià) TBI大鼠神經(jīng)功能；應(yīng)用TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)，評(píng)價(jià)miR-21-5p對(duì)腦組織細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)腦微血管密度，評(píng)價(jià)miR-21-5p對(duì)腦組織血管生成修復(fù)的影響；通過(guò)腦組織干濕重檢測(cè)、血腦屏障（BBB）Evans Blue滲漏量檢測(cè)及緊密連接蛋白（Occludin及Claudin-5）定量檢測(cè)，評(píng)價(jià)miR-21-5p對(duì)BBB通透性的

4、影響。3.應(yīng)用Western Blot和qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)miR-21-5p可能的作用靶點(diǎn)PTEN、AKT信號(hào)通路及其下游蛋白（凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3；血管生成及穩(wěn)定性相關(guān)因子Ang-1、Tie-2）的表達(dá)變化，探討miR-21-5p影響細(xì)胞凋亡、血管生成修復(fù)及BBB通透性的相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.（1）TBI后，創(chuàng)傷灶腦組織miR-21-5p表達(dá)量自傷后6h起逐漸升高，于傷后3d達(dá)

5、峰，隨后逐漸下降，于傷后14d降低至假手術(shù)組大鼠水平；且miR-21-5p在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMVECs）中的原位表達(dá)水平均有不同程度的升高。
　　（2）在TBI前后，miR-21-5p在腦神經(jīng)組織中均主要表達(dá)于神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　?。?）通過(guò)側(cè)腦室注射脂質(zhì)體攜帶的miR-21-5p agomir/antagomir，可以上調(diào)/下調(diào)創(chuàng)傷灶腦組織于傷后6h、1d及3d的miR-21-5

6、p表達(dá)水平，且同時(shí)上調(diào)/下調(diào) miR-21-5p在以上細(xì)胞中的原位表達(dá)水平。
　　2.（1）TBI后，腦組織miR-21-5p表達(dá)水平的升高可以改善神經(jīng)功能預(yù)后。
　　（2） miR-21-5p的表達(dá)可以抑制腦組織細(xì)胞凋亡。
　?。?）miR-21-5p的表達(dá)可以促進(jìn)腦組織血管生成修復(fù)。
　?。?）miR-21-5p的表達(dá)可以減輕BBB滲漏。
　　3.（1）TBI后，腦組織miR-21-5p的表達(dá)量可以影響

7、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　?。?）miR-21-5p可以在轉(zhuǎn)錄后水平靶向抑制腦組織 PTEN基因的表達(dá)，并促進(jìn)Akt磷酸化。
　?。?）miR-21-5p的表達(dá)可以促進(jìn)腦組織血管生成及穩(wěn)定性相關(guān)因子Ang-1及Tie-2的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.TBI后，創(chuàng)傷灶腦組織miR-21-5p表達(dá)水平升高，且在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的原位表達(dá)水平均有不同程度的升高。
　　2.TB

8、I后，miR-21-5p通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因PTEN的表達(dá)，激活A(yù)kt通路，從而調(diào)控下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生抑制腦組織細(xì)胞凋亡的作用。
　　3.TBI后，BMVECs表達(dá)的miR-21-5p通過(guò)激活A(yù)ng-1/Tie-2通路，產(chǎn)生促進(jìn)腦組織血管生成修復(fù)、減輕BBB滲漏的作用。
　　4.TBI后，miR-21-5p可以通過(guò)上述作用，保護(hù)神經(jīng)-血管單元，減輕繼發(fā)性腦損傷，從而改善TBI預(yù)后。
　　5.miR-21