NLRP3介導的神經(jīng)炎癥反應在顱腦創(chuàng)傷中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分線粒體自噬對顱腦外傷后神經(jīng)炎癥反應和神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用
　　目的:研究顱腦外傷后線粒體自噬的發(fā)生情況和具體機制，探討其和神經(jīng)炎癥反應之間的關系。
　　方法:運用臨床標本，以癲癇患者的腦組織為對照組，通過電鏡和western blotting等方法檢測顱腦損傷后腦組織的自噬及線粒體自噬發(fā)生情況;以WT和GFP-LC3轉(zhuǎn)基因Sprague Dawley老鼠為研究對象，運用控制性皮層損傷方法，構建顱腦損傷的動物模型;通過

2、免疫熒光、western blotting、電鏡等檢測線粒體自噬的發(fā)生情況;使用BAF和3-MA兩種不同的自噬抑制劑，檢測其對顱腦外傷后線粒體自噬的影響;依據(jù)外傷后1、3、6以及24小時，取腦組織檢測線粒體自噬和線粒體釋放Cyt C的情況，研究線粒體自噬和細胞死亡在時間上的關系;檢測正常狀態(tài)下和顱腦外傷后心磷脂在線粒體上的分布情況;抑制PLS3或者CLS，干擾心磷脂的重新分布，檢測其對顱腦外傷后線粒體自噬的影響;使用線粒體自噬抑制劑md

3、ivi-1，Sprague Dawley大鼠分為sham組，TBI組和TBI+mdivi-1組;TUNEL和western blotting檢測損傷后細胞凋亡情況;腦缺損面積實驗，檢測腦組織損傷情況;平衡木實驗和水迷宮實驗，探討外傷后神經(jīng)功能恢復情況。
　　結果:1，電鏡顯示顱腦外傷后大量損傷的線粒體被雙層膜包裹，提示顯著增加的線粒體自噬;2，western blotting顯示自噬的標志蛋白LC3-Ⅱ明顯升高，p62下降，線粒體

4、的標志蛋白(COXIV，MnSOD，TOM40)下降;3，免疫熒光顯示GFP-LC3和線粒體共定位明顯增加;4，線粒體自噬發(fā)生早于Cyt c從損傷線粒體釋放;5，心磷脂由線粒體內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至外膜，與LC3結合，阻止心磷脂外翻，抑制顱腦外傷后線粒體自噬;6，抑制線粒體自噬加劇顱腦損傷后神經(jīng)炎癥反應;7，抑制線粒體自噬使腦缺損面積增加;8，干擾大鼠神經(jīng)功能恢復，影響平衡木實驗和水迷宮實驗。
　　結論:1，顱腦損傷后，腦組織線粒體自噬顯著增

5、加;2，線粒體自噬早于細胞凋亡的發(fā)生;3，心磷脂充當識別損傷線粒體的作用，調(diào)節(jié)線粒體自噬;4，線粒體自噬起神經(jīng)保護作用，抑制線粒體自噬會加劇神經(jīng)炎癥反應，阻礙神經(jīng)功能恢復。
　　第二部分 NLRP3炎癥小體在顱腦外傷中的重要作用
　　目的:研究顱腦外傷后神經(jīng)炎癥反應的發(fā)生情況，探討NLRP3在其中的重要調(diào)節(jié)作用，及與預后的關系。
　　方法:運用臨床標本，以癲癇患者的腦組織為對照組，通過免疫組化和westernblott

6、ing等方法檢測顱腦損傷后腦組織的神經(jīng)炎癥發(fā)生情況;運用siRNA敲低NLRP3后，western blotting檢測敲低效果，研究其對顱腦外傷后神經(jīng)炎癥反應的影響;以WT、及NLRP3-/-、caspase-1-/-、IL-1R-/-轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，構建控制性皮層損傷模型，平衡木實驗和水迷宮實驗，探討顱腦外傷后肌力、運動、學習、記憶、認知等神經(jīng)功能恢復情況。
　　結果:1，免疫組化顯示顱腦外傷后NLRP3、IL-1β和I

7、L-18表達增加，提示顯著增強的神經(jīng)炎癥反應;2，western blotting結果顯示caspase-1(P20)和分泌型IL-1β明顯增加;3，運行siRNA敲低n1rp3，使n1rp3低表達，后續(xù)westernblotting結果顯示caspase-1(P20)和IL-1β明顯減少;4，在平衡木實驗和水迷宮實驗中，與WT小鼠相比，NLRP3-/-、caspase-1-/-、IL-1R-/-轉(zhuǎn)基因小鼠的外傷后神經(jīng)功能恢復更好。

8、r>　　結論:1，顱腦損傷后，NLRP3表達增加，神經(jīng)炎癥反應明顯增強;2，敲低NLRP3，顯著減少顱腦外傷引起的神經(jīng)炎癥反應;3，敲除NLRP3，或者caspase-1，或者IL-1R有利于顱腦外傷后神經(jīng)功能恢復。
　　第三部分 Omega-3通過調(diào)節(jié)NLRP3介導的炎癥反應減少顱腦外傷后細胞死亡和改善預后
　　目的:探討omega-3如何抑制顱腦外傷后神經(jīng)炎癥反應，及改善顱腦損傷后神經(jīng)功能缺陷。
　　方法:合籠后第

9、1天，雌鼠被隨機分配接受標準食物（EPA20∶5 n-30.02％和DHA22∶6 n-30.02％），或高ω-3 Fas的飲食（EPA5.3％和DHA23.8％），或者高ω-6 Fas的飲食;術前6周予以ω-3(DHA，22∶6，＃D2534)，或者ω-6(oleic acid,18∶2，＃62160)，或者ω-9(linolenic acid,18∶1，＃O1008)，或者生理鹽水灌胃，2次/周;通過ELISA、western bl

10、otting等檢測不同組的顱腦外傷后神經(jīng)炎癥反應;使用GPR40受體拮抗劑GW1100或者siRNA GPR40，抑制ω-3 Fas的抗炎的作用;通過免疫共沉淀檢測ARRB2與NLRP3結合情況;分離線粒體和胞漿蛋白，檢測NLRP3和線粒體共定位情況;TNUNEL檢測顱腦外傷后細胞死亡情況，同時使用western blotting檢測cleaved-caspase-3表達水平;使用腦水腫實驗和腦缺損面積，檢測腦損傷情況;使用平衡木實驗和

11、水迷宮實驗探討外傷后神經(jīng)功能恢復情況。
　　結果:1，與sham組相比，ELISA結果顯示ω-3Fas抑制顱腦外傷誘導的IL-1β、IL-18和IL-6;2，omega-6或-9不能抑制caspase-1和IL-1β的激活;3，siRNAGPR40或者GW1100能夠顯著抑制ω-3Fas的抵抗炎癥作用;4，免疫共沉淀結果顯示ω-3Fas促進GPR40下游蛋白ARRB2與NLRP3相結合;5，分離線粒體蛋白和胞漿蛋白，后續(xù)weste

12、rn blotting結果顯示ω-3Fas抑制NLRP3與損傷的線粒體結合，從而減少cleaved-caspase-1和IL-1β的表達;6，ω-3Fas可顯著減少顱腦外傷引起的細胞死亡;7，ω-3Fas減少顱腦外傷引起的皮層缺損和腦水腫，促進運動和認知能給恢復;8，GW1100抑制ω-3Fas對于顱腦外傷的神經(jīng)保護作用。
　　結論:1，ω-3Fas改善腦外傷引起的神經(jīng)炎癥反應和神經(jīng)功能行為缺陷;2，ω-3Fas通過GPR40促進