Toll樣受體-髓樣分化因子88介導的炎癥反應(yīng)在視神經(jīng)創(chuàng)傷與修復中的作用.pdf

1、視神經(jīng)在眼眶內(nèi)活動程度受限,以致在頭部受到外力沖擊時極易造成直接和間接的原發(fā)性損傷,以及其后產(chǎn)生的包括血管痙攣或栓塞導致視神經(jīng)的缺血、變性或壞死,以及免疫與炎性反應(yīng)等繼發(fā)性損害。髓樣分化因子88(MyD88)是多種固有免疫受體在細胞內(nèi)的銜接蛋白,其依賴途徑參與脊髓損傷與修復,在腦損傷后的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。視神經(jīng)同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此我們認為MyD88可能是調(diào)控視神經(jīng)創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的靶點,對視神經(jīng)損傷的修復發(fā)揮重要作用。
　　本

2、研究分以下四個部分:(1)成年SD大鼠視神經(jīng)夾傷/離斷模型的建立與改良;(2)阻斷MyD88通路對成年大鼠視神經(jīng)離斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)存活的影響;(3)阻斷MyD88通路對成年大鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)干中TLR4、NF-κB表達的影響;(4)阻斷MyD88通路對成年大鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)干中GAP-43表達的影響。
　　第一部分:成年大鼠視神經(jīng)夾傷與離斷模型的建立和改良
　　成年大鼠視神經(jīng)夾傷/離斷模型已趨成熟,在

3、相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。然而,既往建模手術(shù)方法繁瑣,難度較大,手術(shù)耗時較長,加之目前常用的單一麻醉方法容易造成大鼠呼吸抑制而死亡。本文作者在建立視神經(jīng)損傷動物模型時,在開創(chuàng)部位、操作方法和麻醉方法等方面進行了改良。
　　結(jié)論:以戊巴比妥和陸眠寧聯(lián)合麻醉取代單一戊巴比妥鈉麻醉,并使用可產(chǎn)生恒定夾傷力的特制動脈瘤夾,能夠縮短手術(shù)時間,并降低手術(shù)難度和實驗動物的死亡率。
　　第二部分:阻斷MyD88通路對視神經(jīng)離斷后RGCs存

4、活的影響
　　方法:成年大鼠左側(cè)視神經(jīng)離斷后隨機分為三組:(1)MIP實驗組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射MyD88抑制肽;(2)CP對照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射對照肽;(3)PBS對照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射PBS緩沖液。術(shù)后14d處死各組大鼠,視網(wǎng)膜取材,4％多聚甲醛后固定后視網(wǎng)膜全鋪片,計數(shù)熒光金逆行標記的RGCs并計算出存活RGCs平均密度。
　　結(jié)果:MIP實驗組存活節(jié)細胞平均密度(1206±134/mm2)較 CP對照組(90

5、8±112/mm2)和PBS對照組(879±123/mm2)顯著增高(p<0.01),而CP和PBS兩對照組間無顯著差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:阻斷MyD88通路對成年大鼠視神經(jīng)損傷后的RGCs具有神經(jīng)保護作用。
　　第三部分:阻斷MyD88通路對夾傷視神經(jīng)干中TLR4和NF-kB表達的影響
　　方法:成年大鼠左側(cè)視神經(jīng)夾傷后隨機分為四組:(1)MIP實驗組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射MyD88抑制肽;(2)CP對照組:

6、左眼玻璃體腔內(nèi)注射對照肽;(3)PBS對照組:左眼玻璃體腔內(nèi)注射PBS緩沖液;(4)空白對照組:視神經(jīng)夾傷后未予任何處理。于視神經(jīng)損傷后1d、3d、7d或14d處死動物,視神經(jīng)干取材行蛋白質(zhì)免疫印記(Western Blot)實驗。
　　結(jié)果:(1)與空白對照組相比,MIP實驗組、CP對照組和PBS對照組TLR4蛋白表達量在1d、3d、7d及14d所有時間點均顯著增高(p<0.01);在術(shù)后1d時間點,MIP實驗組、CP對照組和P

7、BS對照組間TLR4蛋白表達量無統(tǒng)計學差異(p>0.05);當術(shù)后存活時間升至3d、7d及14d時,MIP實驗組較CP對照組及PBS對照組TLR4蛋白表達量顯著降低(p<0.01),而CP對照組和PBS對照組間均無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。(2)與空白對照組相比,MIP實驗組、CP對照組和PBS對照組NF-κB蛋白表達量在1d、3d、7d及14d所有時間點均顯著增高(p<0.01);MIP組NF-κB表達量在各時間點較CP對照組和PB

8、S對照組均有顯著降低(p<0.01),但CP對照組和PBS對照組在各時間點的NF-κB表達量并無明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:早期阻斷MyD88通路對視神經(jīng)損傷后RGCs的保護作用,與TLR4和NF-κB蛋白表達的下調(diào)相關(guān)。
　　第四部分:阻斷MyD88通路對夾傷視神經(jīng)干中GAP-43表達的影響
　　第四部分采用夾傷模型的建造及處理方法,分為四組,即完全空白對照的Con組、以及經(jīng)手術(shù)和術(shù)后玻璃體注射處理的MIP

9、組、CP組及PBS組。待模型制造完成后于1d、3d、7d及14d不同時間點對大鼠處死進行視神經(jīng)干的取材。視神經(jīng)干組織直接存放于-70℃冰箱待進行Western-blot實驗。
　　結(jié)果:在視神經(jīng)損傷后1d、3d、7d及14d所有時間點,MIP實驗組、CP對照組和PBS對照組GAP-43蛋白表達量與空白對照組相比均顯著增高(p<0.01),MIP實驗組較CP對照組和PBS對照組GAP-43蛋白表達量顯著增高(p<0.01),而CP對