Toll樣受體3介導(dǎo)病毒促進(jìn)垂體瘤增殖侵襲的機制研究.pdf

1、背景和目的:垂體瘤占顱內(nèi)腫瘤約15％，其組織學(xué)為良性，但是有25-55％的垂體瘤朝周圍結(jié)構(gòu)浸潤，比如鞍隔的骨性組織，篩竇和/或海綿竇等，這些垂體瘤稱為侵襲性垂體瘤。垂體瘤的侵襲性常與高Ki-67指數(shù)，并與嚴(yán)重的癥狀、更差的預(yù)后、高復(fù)發(fā)率、以及藥物替代治療的低反應(yīng)性相關(guān)。現(xiàn)有的研究已表明，染色體、基因(如:11p/q，p53)，粘附分子（如:E-cadherin），金屬基質(zhì)蛋白（如:MMP2，MMP8），炎癥因子（如:IL-6，IL-17

2、）的異常變化與垂體瘤的進(jìn)展、侵襲相關(guān)。但評估、解釋其侵襲性的特異性的組織學(xué)和分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)卻依然缺乏。不僅如此，現(xiàn)有的研究多從垂體瘤自身基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等幾個層面上的異常變化探索其侵襲性的來源，極少研究聚焦于外界環(huán)境如微生物感染等對垂體瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
　　15-20％的人類腫瘤都與促腫瘤病毒相關(guān)。促腫瘤病毒促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的一重要機制是慢性感染常導(dǎo)致氧化應(yīng)激與炎癥，受感染的細(xì)胞分泌炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-

3、α，形成炎癥環(huán)境（inflammatory milieu），炎癥刺激、影響、激活NF-κB、STAT3及MAPKs等信號通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。近年的研究發(fā)現(xiàn)，模式識別受體(PRRs)不僅表達(dá)在免疫細(xì)胞，還能在腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)。PRRs中最常見的是Toll樣受體(TLR)家族，其家族的多個成員如TLR2，TLR3，TLR4等均已證實在某些腫瘤中表達(dá)，且參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其中與病毒感染最為密切相關(guān)的是TLR3。各種來源雙鏈RNA(dsRN

4、A)，壞死細(xì)胞來源或相關(guān)的RNA和人工合成的Poly(I∶C)均是TLR3的配體。病毒雙向轉(zhuǎn)錄過程中形成的dsRNA可激活TLR3，這與病毒類型（DNA病毒、RNA病毒等）無關(guān)。
　　已有大量的研究表明，高危HPV16被發(fā)現(xiàn)與人類多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，包括宮頸癌、口咽癌、肛門癌以及頭頸部癌等。不僅如此，某些腫瘤中HPV16陽性的腫瘤細(xì)胞可更多朝周圍結(jié)構(gòu)侵襲，以及更遠(yuǎn)處的遷移。HHV6是嗜B淋巴細(xì)胞病毒，與兒童淋巴瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。

5、而HSV1則與乳腺癌病人總體存活率相關(guān)，并且與吸煙、飲酒、HPV感染等因素綜合決定頭頸部癌的發(fā)生。在垂體瘤中，尚未有報道其發(fā)生發(fā)展與某種病毒感染有關(guān)，因此，本研究擬檢測侵襲性與非侵襲性垂體瘤中前述三個促腫瘤病毒（HPV16，HSV1以及HHV6B）的感染情況，探討病毒感染與垂體瘤侵襲、增殖之間的關(guān)系。并且在體外垂體瘤細(xì)胞系中，探索病毒作用的分子機制，為臨床上預(yù)估、治療侵襲性垂體瘤提供新的思路。
　　方法:
　　1.利用免疫組

6、織化學(xué)、巢式PCR等技術(shù)，研究HPV16、HSV1、HHV6B DNA、病毒蛋白在垂體瘤病人病理標(biāo)本中的表達(dá)。
　　2.利用qRT-PCR以及免疫組織化學(xué)的方法檢測垂體瘤病人病理標(biāo)本中TLR3mRNA以及蛋白水平的表達(dá)。
　　3.利用大鼠垂體瘤細(xì)胞系GH3細(xì)胞系在體外探究TLR3對細(xì)胞侵襲、增殖能力的影響以及分子機制探究。
　　結(jié)果:
　　1.HPV16和HHV6B在侵襲性垂體瘤標(biāo)本中感染率更高
　　60例

7、垂體瘤標(biāo)本中，HPV16在侵襲性垂體瘤陽性檢測率為70％，非侵襲性垂體瘤陽性檢測率為26.67％，侵襲性垂體瘤組中HPV16的陽性檢測率顯著高于非侵襲性組(P＜0.01); HHV6B在侵襲性垂體瘤中的陽性檢測率為55.33％，在非侵襲性垂體瘤中陽性檢測率為23.33％，兩者之間差異顯著(P＜0.05); HSV1在侵襲性垂體瘤的檢出率為50％，非侵襲性垂體瘤檢出率為30％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。因此，HPV16、HHV6B

8、感染與垂體瘤的侵襲性正相關(guān)，而HSV1的感染與垂體瘤侵襲性無關(guān)。
　　2.TLR3的mRNA與蛋白在侵襲組中表達(dá)均顯著高于非侵襲性PA組，且與HPV16、HHV6B感染率正相關(guān)。
　　在mRNA水平上，我們檢測了侵襲性垂體瘤組與非侵襲性垂體瘤組中與病毒感染相關(guān)的TLRs中的TLR3、4、7、8、9的表達(dá)，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅TLR3在侵襲性與非侵襲性組之間有差異(P＜0.01)。在侵襲組中，TLR3在mRNA水平上表達(dá)增加。緊

9、接著，我們又用免疫組化的方法檢測了TLR3蛋白水平的表達(dá)。TLR3的蛋白在每一例垂體瘤患者標(biāo)本中均檢測出有表達(dá)，且TLR3表達(dá)在胞漿。通過對TLR3蛋白表達(dá)的定量統(tǒng)計，我們發(fā)現(xiàn)TLR3蛋白水平在侵襲性組顯著高于非侵襲性組(P＜0.01)。通過統(tǒng)計學(xué)方法分析TLR3表達(dá)量與HPV16、HHV6B感染率之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染率與TLR3表達(dá)之間呈正相關(guān)。
　　3.TLR3的激活可促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞系GH3的增殖
　　我們在8個

10、時間點上檢測了200μg/ml Poly(I∶C)對GH3細(xì)胞系的影響。生長曲線結(jié)果顯示，在分析的時間點內(nèi)，Poly(I∶C)可以促進(jìn)GH3細(xì)胞的增殖。
　　4.TLR3的激活可影響GH3細(xì)胞系的凋亡與細(xì)胞周期
　　Poly(I∶C)處理組與對照組對比可以發(fā)現(xiàn)，處理組中更少的凋亡細(xì)胞，更多的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S期?？沟蛲龅腂cl-2在Poly(I∶C)處理組中表達(dá)增加，促凋亡剪切活化的Caspase3在添加Poly(I∶C)

11、組中的表達(dá)更少。而促進(jìn)凋亡的Bax蛋白在幾個處理組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與此同時，我們檢測了促進(jìn)細(xì)胞從G1/G0期進(jìn)入S期的蛋白Cyclin D1，我們發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1的表達(dá)在Poly(I∶C)處理組中增多。
　　5.TLR3的激活可促進(jìn)GH3細(xì)胞的侵襲
　　在預(yù)先TLR3-siRNA預(yù)處理或未處理的Transwell上室中，加入Poly(I∶C)。48小時后，侵襲的細(xì)胞被染色和計數(shù)。統(tǒng)計分析顯示，Poly(I∶C)

12、處理組穿過上室的細(xì)胞更多。
　　6.TLR3下游的NF-κB被激活
　　我們運用免疫熒光的方法檢測了Poly(I∶C)刺激后NF-κB p65亞基的亞細(xì)胞定位。不僅如此，我們還分別檢測了p65分別在細(xì)胞漿、核中的表達(dá)水平。在Poly(I∶C)刺激24小時后，更多的p65轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核內(nèi)，同時p65蛋白的表達(dá)水平在核內(nèi)也是高于胞漿。
　　7.Poly(I∶C)刺激GH3后，下游腫瘤侵襲相關(guān)蛋白與炎癥因子的分泌增加。

13、>　　我們發(fā)現(xiàn)，GH3在Poly(I∶C)刺激后MMP9表達(dá)的增加，與體外研究一致，我們發(fā)現(xiàn)在人侵襲性PA病理標(biāo)本中MMP9的表達(dá)水平高于非侵襲性組。NF-κB的激活可導(dǎo)致某些炎癥因子的分泌。Poly(I∶C)刺激GH3細(xì)胞后，可導(dǎo)致下游NF-κB的激活。因此我們檢測了NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥因子IL-6，IL-1β與TNFα，三者在Poly(I∶C)干擾組中分泌均上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.HPV16，HHV6B的感染率與