2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)是引起肝臟疾病的重要病原體,感染者大部分發(fā)展為慢性感染,最后可導(dǎo)致肝纖維化,肝硬化和肝癌,而且目前還沒有有效的疫苗來(lái)預(yù)防HCV的感染。聚乙二醇化干擾素-α(pegylated interferonα,PEG-IFN-α)和利巴韋林(ribavirin,RBV)是治療丙肝的最佳藥物,但仍有約為30%-50%的HCV感染者對(duì)該聯(lián)合抗病毒治療無(wú)效。HCV core蛋白是病毒感染肝細(xì)胞后第

2、一個(gè)表達(dá)的蛋白,在感染的靶細(xì)胞和患者的血清中均可檢測(cè)到其存在。HCV core蛋白不僅參與病毒顆粒的組裝,還可與靶細(xì)胞不同蛋白相互作用調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能,包括細(xì)胞的增殖,生長(zhǎng),凋亡等。
  固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線,肝臟組織中的庫(kù)否氏細(xì)胞是重要的固有免疫應(yīng)答細(xì)胞,屬于定居的巨噬細(xì)胞,參與機(jī)體的免疫防御。目前認(rèn)為,巨噬細(xì)胞是一類異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞群體,在組織微環(huán)境中可被刺激分化為具有不同功能的細(xì)胞亞群。包括經(jīng)典活

3、化的M1巨噬細(xì)胞、旁路活化的M2巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞等。本室前期結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),HCV core蛋白可刺激巨噬細(xì)胞THP1分泌促炎和抑炎因子,因此,本研究擬通過收集HCV core蛋白作用的THP1上清,從不同的角度觀察培養(yǎng)上清對(duì)正常肝細(xì)胞株L02、肝癌細(xì)胞株(HepG2、SMCC-7721)的增殖、遷移、侵襲以及對(duì)干擾素作用的影響,并初步探討其機(jī)制,為進(jìn)一步研究HCV core蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  方

4、法:
  1、構(gòu)建與表達(dá)重組HCV core蛋白
  從JFH-1株(HCV2a)全長(zhǎng)基因質(zhì)粒上通過PCR的方法擴(kuò)增HCV core基因,連接至pMD18-T載體上,測(cè)序正確后,經(jīng)BamHⅠ,HindⅢ雙酶切,與pET28a相連,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HCV core,雙酶切鑒定。經(jīng)IPTG37℃誘導(dǎo)獲得表達(dá)core蛋白的包涵體,經(jīng)純化,復(fù)性和濃縮后,行SDS-PAGE和Western blot鑒定。
  

5、2、獲得HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞m-THP1培養(yǎng)上清
  PMA(10 ng/ml)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP1分化為巨噬細(xì)胞m-THP1,HCV core蛋白以20μg/ml刺激m-THP124h后收集上清,離心。-80℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組與加HCV core蛋白無(wú)細(xì)胞的空白對(duì)照組。
  3、觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
  將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清用完全培養(yǎng)基20%或50%稀釋后分別培養(yǎng)

6、人正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞HepG2或SMMC7721細(xì)胞:1)通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8法),劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及克隆增殖實(shí)驗(yàn)觀察稀釋后的培養(yǎng)上清對(duì)上述肝細(xì)胞細(xì)胞增殖,遷移能力的影響;2)通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三種肝細(xì)胞株MMP2和MMP9基因的表達(dá)變化;3)Westernblot檢測(cè)三種肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65及MAPKs通路相關(guān)蛋白(ERK,JNK,p38)的表達(dá)。
  4、觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清和

7、IFN-α對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響
  在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別培養(yǎng)L02、HepG2和SMCC7721三種肝細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基(含IFN-α1000 U/孔),1h后加入不同組分的細(xì)胞培養(yǎng)上清,使各孔終體積均為200 ul,分別在刺激肝細(xì)胞24h、48h時(shí)檢測(cè)其增殖變化。以了解在core蛋白作用的THP1產(chǎn)物對(duì)干擾素抗病毒作用的影響。設(shè)組情況如下:core蛋白作用的THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清+IFN-α刺激組為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)IF

8、N-α單獨(dú)刺激組、core蛋白作用的THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激組、THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清+IFN-α刺激組為對(duì)照組。
  結(jié)果:
  1、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HCV core(含有2個(gè)His標(biāo)簽),經(jīng)BamHⅠ,HindⅢ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳有約575bp大小片段存在,測(cè)序結(jié)果顯示與Genbank記載序列一致。
  2、獲得原核表達(dá)重組蛋白HCV core,純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blo

9、t結(jié)果顯示獲得分子量約為21KD的單一條帶,并測(cè)得其濃度為0.5μg/μl。
  3、HCV core蛋白作用的m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲:1)與對(duì)照組相比,50%稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí)可促進(jìn)L02、HepG2以及SMMC7721細(xì)胞的增殖(P<0.05);2)在劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,20%稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠明顯促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞的遷移(P<0.01),50%稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清可

10、明顯促進(jìn)L02細(xì)胞的遷移(P<0.01),兩種濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)HepG2細(xì)胞的遷移無(wú)影響。在平板克隆形成試驗(yàn)中,對(duì)三種細(xì)胞均無(wú)明顯影響。
  4、HCV core蛋白作用的m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清可干擾IFN-α抑制肝細(xì)胞增殖的作用:與對(duì)照組相比,IFN-α(1000U/孔)可明顯抑制肝細(xì)胞的增殖,而core蛋白作用的m-THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠干擾IFN-α的這種抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
  5、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

11、顯示:與純粹的m-THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清和HCV core空培養(yǎng)基對(duì)照組相比,20%稀釋的核心蛋白刺激下的m-THP1上清作用可顯著促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞MMP9的表達(dá)(P<0.05); L02和HepG2細(xì)胞MMP9和MMP2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比并無(wú)顯著變化。
  6、core蛋白作用m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清作用SMMC-7721細(xì)胞,檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,Western blot結(jié)果顯示,與PBS作用m-THP1的細(xì)胞培

12、養(yǎng)上清和HCV core空培養(yǎng)基對(duì)照組相比,core蛋白作用m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清后可使p-ERK的表達(dá)明顯降低,p-38的表達(dá)并無(wú)明顯變化,磷酸化的NF-κB65表達(dá)升高。
  結(jié)論:
  1、成功構(gòu)建、表達(dá)了HCV core蛋白。
  2、HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清可促進(jìn)L02、HepG2、SMMC-7721的增殖;促進(jìn)L02、SMMC-7721的遷移可能與NF-κB存在一定關(guān)聯(lián)。
  3、

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