舌癌Tca-83細(xì)胞培養(yǎng)上清對樹突狀細(xì)胞表型及功能影響的研究.pdf

1、目的：近年來，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)已成為生物醫(yī)學(xué)界腫瘤生物免疫治療十分關(guān)注的研究熱點(diǎn)。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，它是啟動(dòng)、調(diào)控及維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，對維持正常機(jī)體免疫系統(tǒng)自穩(wěn)態(tài)起重要作用，在機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答中處于核心地位。諸多研究證實(shí)，DC能在體外攝取腫瘤抗原，并在體內(nèi)激活初始T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，從而在腫瘤免疫中

2、發(fā)揮至關(guān)重要的作用。有研究表明腫瘤患者的DC，尤其是腫瘤組織中的DC存在著免疫功能缺陷，這與腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制和免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。本研究擬通過培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞株Tca83細(xì)胞，探討其培養(yǎng)上清對DC的表型及功能的影響，從而尋找腫瘤本身逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的可能機(jī)制，為提高機(jī)體抗腫瘤免疫能力的途徑提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選取身體健康的志愿者15人，最小年齡23歲，最大年齡26歲，其中男8人，女7人。無菌采集取志愿者

3、外周血50ml，置入淋巴細(xì)胞分離液中，經(jīng)離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，吸取中間細(xì)胞層，用D-Hank's和RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，棄上清，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'7>個(gè)/ml，然后接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3ml。5％CO<,2>、37℃條件下孵育2小時(shí)后，吸出培養(yǎng)上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗板1次，以去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononucl

4、earcell，PBMC)。將PBMC分為2組，實(shí)驗(yàn)組：在體外用rhGM-CSF、rhIL-4和腫瘤上清液誘導(dǎo)單核細(xì)胞增殖分化成DC；對照組：即常規(guī)培養(yǎng)組，在體外用rhGM-CSF、rhIL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞增殖分化成DC，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，中間適量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子。5％CO<,2>、37℃孵育5天后，對照和實(shí)驗(yàn)組每孔加入TNF-a 200u/ml，7天后收集各組DC。第1、3、5、7天用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)；第7天每組取DC,直接免疫

5、熒光染色法染色，流式細(xì)胞分析各組DC表面分子CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)情況。各組收集DC，掃描和透射電子顯微鏡下觀察DC的形態(tài)。用ELISA法檢測兩組DC培養(yǎng)第7天上清中的IL-12的含量，通過以上方法觀察腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對樹突狀細(xì)胞的表型和功能的影響。 結(jié)果：倒置顯微鏡下，可見誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后貼壁單核細(xì)胞聚集成少量大小不等的細(xì)胞聚體，實(shí)驗(yàn)組和對照組無明顯的的區(qū)別。第3天可見細(xì)胞聚集成團(tuán)，實(shí)驗(yàn)組

6、集落數(shù)明顯少于對照組，部分細(xì)胞體積增大。第5天，懸浮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞表面有細(xì)小突起形成，細(xì)胞體積明顯變大，以對照組更明顯。第7天懸浮細(xì)胞有明顯樹突狀突起，以對照組更明顯，對照組細(xì)胞體積較大。培養(yǎng)第7天掃描電鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組DC表面突起較少且短，而且數(shù)量明顯少；對照組DC表面粗糙，胞體向周圍伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起。實(shí)驗(yàn)組第7天透射電鏡觀察，DC細(xì)胞表面伸出少量的突起，線粒體致密化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池狀，溶酶體較少，有較多的空泡；

7、而對照組有較多的樹枝樣突起，空泡較少。培養(yǎng)7天后，實(shí)驗(yàn)組CD80、CD83、HLA-DR的表達(dá)率較對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，但CD86、CD1a、表達(dá)率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組DC分泌IL-12的量明顯低于對照組(23.6±5.2 pg/ml對37.2±5.8pg/ml，p<0.05)。 結(jié)論：1、舌癌Tca-83細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠抑制樹突狀細(xì)胞分化和成熟，表現(xiàn)為DC的樹突狀突起明顯減少