2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)不但是先天免疫、適應(yīng)性免疫的中心調(diào)控者,而且在免疫耐受中起關(guān)鍵作用。迄今為止,樹突狀細胞被認為是最有效的抗原提呈細胞,根據(jù)其表型、部位不同,功能也千差萬別。多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是神經(jīng)系統(tǒng)常見的自身免疫性疾病,主流觀點認為MS的發(fā)生與T細胞的異常活化密切有相關(guān),其中包括Th1/Th2失衡及Treg/Th17失衡,而樹突狀細胞是其平衡的主要調(diào)控細胞

2、。近年來,對MS免疫機制及耐受誘導治療成為研究熱點。本實驗利用改良son法體外培養(yǎng)未成熟DC及成熟DC細胞,分析比較兩種細胞培養(yǎng)上清液中IL-23、IL-35的表達量,探討IL-23、IL-35在DC細胞的正性免疫應(yīng)答及免疫耐受機制中的意義,為MS的治療尋求新的方向。
  方法:
  1.離體分離培養(yǎng)未成熟及成熟樹突狀細胞
  取清潔級C57BL/6雌鼠,拉頸處死,依次浸泡于碘伏、75%酒精、75%酒精5min、2mi

3、n、2min。無菌彎鑷及剪刀剝離干凈小鼠腿部肌肉,浸泡股骨于無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)之中2min,無菌紗布擦拭股骨表面,浸泡于含有青鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中。于股骨兩端及中央打孔,無菌RPMI-1640沖洗骨髓腔,200目細胞篩過濾、紅細胞裂解液裂解紅細胞、RPMI-1640清洗。使用含10%胎牛血清、10ng/ml白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)、1

4、0ng/ml粒細胞巨噬細胞刺激因子(granulocytemacrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的RPMI-1640懸浮骨髓液,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,接種于六孔板。分別于48h、96h全量及半量換液,補充細胞因子,第5天收集懸浮細胞即為未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells,imDCs);第6天補充細胞因子干擾素-γ(interferon-γ,IFN

5、-γ),第7天收集懸浮細胞即為成熟樹突狀細胞(mature dendritic cells,mDCs)。
  2.流式細胞儀分選純化樹突狀細胞
  分別收集第5天及第7天懸浮細胞,離心,CD11c標記,無菌條件下經(jīng)流式細胞儀分選,收集CD11c+細胞,即為未成熟及成熟樹突狀細胞。
  3.細胞鑒定
  3.1 細胞形態(tài)學鑒定
  3.1.1 熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)
  3.1.2 掃描電鏡觀察細胞

6、表面形態(tài)
  3.1.3 透射電鏡觀察細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)
  3.2 流式細胞學檢測細胞表面CD11c、MHCII、CD80、CD86分子表達情況
  分別于第5天及第7天收集六孔板中懸浮細胞,流式細胞儀檢測細胞表面CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的分子表達情況。
  4.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測細胞上清白細胞介素23(

7、interleukin-23,IL-23)、白細胞介素35(interleukin-35,IL-35)含量。
  5.統(tǒng)計分析
  定量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩獨立樣本采用t檢驗,多組之間采用方差分析,以P<0.05有統(tǒng)計學意義。
  結(jié)果:
  1.細胞形態(tài)學
  1.1 熒光倒置顯微鏡下細胞形態(tài)
  隨著時間延長,顯微鏡下可見細胞數(shù)量增多,體積變大,48h可見較多細胞貼壁生長,少量懸

8、浮,96h可見細胞表面有突起,形態(tài)不一,第5天可見較多細胞懸浮,聚集成團,第7天可見大量細胞懸浮,表面突起較多,集落增多,符合mDCs形態(tài)。
  1.2 掃描電鏡下細胞形態(tài)
  imDCs表面突起短、細、少,DCs表面突起長、粗、大,外形類似樹枝,表面皺褶較imDCs多。
  1.3 透射電鏡下細胞形態(tài)
  imDCs細胞核不規(guī)則,偏向一側(cè),胞質(zhì)細胞器較少,可見較多溶酶體;mDCs細胞核也不規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)溶酶體減少

9、,高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體較多。
  2.細胞表面分子表達情況
  使用流式細胞儀分選懸浮細胞,imDCs表面CD11c單陽性率可達82.922±0.637%,CD11c+MHCII+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+雙陽性率可達46.075±5.742%、8.057±2.307%、5.943±0.308%,CD11c+MHCII+CD80+和CD11c+MHCII+CD86+三陽性率分別為8.810±0.64

10、2%、5.747±0.255%;mDCs表面CD11c單陽性率可達91.143±0.751%,CD11c+MHCII+、CD11c+CD80+、 CD11c+CD86+雙陽性率可達68.040±2.527%、46.397±2.982%、47.330±0.430%, CD11c+MHCII+CD80+和CD11c+MHCII+CD86+三陽性率分別為15.810±1.773%、10.290±0.393%,imDCs與mDCs表面CD11c

11、單陽性率、CD11c+MHCII+雙陽性率、CD11c+CD80+雙陽性率、CD11c+CD86+雙陽性率、CD11c+MHCII+CD80+三陽性率以及CD11c+MHCII+CD86+的三陽性率之間有差異,且P<0.05。
  3.IL-23、IL-35水平的變化
  與imDCs相比,mDCs中IL-23水平上升,IL-35水平下降,P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
  結(jié)論:
  1.采用IL-4聯(lián)合GM

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