生長(zhǎng)激素、胰島素對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫表型和免疫功能的影響研究.pdf

1、腫瘤生物治療(Biotherapy)是惡性腫瘤綜合治療中重要的手段之一,它以獨(dú)特的療效和近乎不存在的毒副作用越來(lái)越受到患者和腫瘤工作者的青睞,是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)品進(jìn)行腫瘤防治的新療法,它通過(guò)調(diào)動(dòng)宿主的天然防衛(wèi)機(jī)制或給予天然(或基因工程)產(chǎn)生的靶向性很強(qiáng)的物質(zhì)來(lái)取得抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤生物治療包括體細(xì)胞療法與細(xì)胞因子療法、腫瘤疫苗與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)、腫瘤分子靶向治療、放射免疫靶向治療、腫瘤基因治療和生

2、物化療等。DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity t lymphocyte,CTL)是目前研究的熱點(diǎn)之一,也是體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)療效明確的生物治療方法之一。DCs用于腫瘤治療已進(jìn)入Ⅰ和Ⅱ期臨床研究,所涉及的腫瘤包括惡性黑色素瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、尤文肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤、乳腺癌等,并且取得了令人鼓舞的療效。
　　 DCs是體內(nèi)最有效的專職抗原遞呈細(xì)胞(antig

3、en presenting cell,APC),是識(shí)別病原侵入的第一道防線,機(jī)體的免疫識(shí)別首先由DCs捕獲、加工和處理抗原,再將抗原遞呈給T、B淋巴細(xì)胞,從而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答,在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的免疫監(jiān)視功能。
　　 但是以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率相對(duì)比較低,分析可能的因?yàn)橛?一、誘導(dǎo)獲得的DCs功能活性低和/或數(shù)量少,不能有效地將抗原呈遞給并激活T淋巴細(xì)胞；二、獲得的CTL細(xì)胞功能活性低,細(xì)胞毒性不足以

4、有效地殺傷腫瘤細(xì)胞；三、CTL和腫瘤細(xì)胞作用的環(huán)境中后,無(wú)具有“催化作用”的生物活性物質(zhì)催化/放大這種殺傷活性。
　　 設(shè)想有一些生物活性物質(zhì),可以打開(kāi)誘導(dǎo)獲取DCs的“限速閘門”而發(fā)揮生物放大效應(yīng),快速獲得大量的具有免疫激活效應(yīng)的DCs；設(shè)想有一些生物活性物質(zhì)能在DCs和T淋巴細(xì)胞作用時(shí)發(fā)揮“催化放大”功能,高效呈遞抗原,有效激活T淋巴細(xì)胞成為具有高級(jí)殺傷功能的CTL細(xì)胞；設(shè)想有一些生物活性物質(zhì)能在CTL與腫瘤細(xì)胞接觸的局部環(huán)

5、境中發(fā)揮“酶促”效應(yīng),極度放大殺傷活性。
　　 人體內(nèi)的激素是由內(nèi)分泌系統(tǒng)的內(nèi)分泌細(xì)胞所分泌的,可傳遞信息的高效能生物活性物質(zhì),分為胺類、多肽與蛋白質(zhì)類和脂類激素3大類,近50種之多。激素是體內(nèi)的最高效能的生物活性物質(zhì),在生理狀態(tài)下,血液中的激素濃度都很低,多為納摩爾(nmol/L),甚至為皮摩爾(pmol/L)數(shù)量級(jí),但是激素與細(xì)胞的受體結(jié)合后,可引發(fā)一系列酶促反應(yīng),并逐級(jí)擴(kuò)大其后續(xù)效應(yīng),形成效能極高的生物放大系統(tǒng),發(fā)揮出激素

6、類物質(zhì)的生物放大效應(yīng)。本研究分為以下二部分:
　　 一、在體外觀察、檢測(cè)了不同濃度的生長(zhǎng)激素對(duì)DCs免疫表型和免疫功能的影響,并觀察了生長(zhǎng)激素受體拮抗劑培維索孟對(duì)生長(zhǎng)激素修飾DCs效應(yīng)的拮抗效應(yīng)。
　　 二、在體外觀察、檢測(cè)了不同濃度的胰島素對(duì)DCs免疫表型和免疫功能的影響,并檢測(cè)了胰島素修飾下獲得的DCs誘導(dǎo)的CTL對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的體外殺傷活性。
　　 第一部分生長(zhǎng)激素對(duì)臍血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的影響

7、　　 目的在體外檢測(cè)生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)對(duì)臍血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的免疫表型和功能狀態(tài)的影響。
　　 方法：從新鮮臍帶血中分離出單核細(xì)胞,應(yīng)用白細(xì)胞介素4和粒巨噬集落刺激因子誘導(dǎo)刺激單核細(xì)胞,不同濃度的GH做為修飾因子修飾DCs誘導(dǎo)過(guò)程,設(shè)立空白對(duì)照組陰性對(duì)照組(氫化可的松作為修飾因子)和陽(yáng)性對(duì)照組(以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為修飾因

8、子)；觀察DCs形態(tài)、數(shù)目、生長(zhǎng)狀態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs的免疫表型,ELISA方法測(cè)定DCs上清液中白細(xì)胞介素-12,自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定其功能狀態(tài)；應(yīng)用培維索孟作為GH拮抗劑觀察拮抗后的效應(yīng)。
　　 結(jié)果：臍血貼壁的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF和GH的誘導(dǎo)下可以分化為成熟DCs,不同濃度(5ug/L～100ug/L)GH均可顯著上調(diào)DCs細(xì)胞表面HLA-DR、CD1α、CD80和CD83分子表達(dá)的陽(yáng)性率(P<

9、0.05),明顯提高DCs分泌IL-12的能力(P<0.05),DCs對(duì)自體淋巴細(xì)胞的激活功能明顯增強(qiáng)(P<0.05)；培維索孟能有效拮抗GH對(duì)DCs的上述效應(yīng)。
　　 結(jié)論：(1).GH可明顯促進(jìn)DCs的誘導(dǎo)過(guò)程,修飾加速DCs的成熟并提高細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá),增強(qiáng)DCs IL-12分泌和激發(fā)自身淋巴細(xì)胞增殖能力。(2).GH修飾DCs的誘導(dǎo)獲取過(guò)程,可獲得更高比例成熟型DCs細(xì)胞群,并且該DCs細(xì)胞群具有更強(qiáng)的免疫激活功能

10、。(3).GH對(duì)DCs免疫特征和功能的修飾與GH的濃度有一定范圍內(nèi)的正相關(guān)性。(4).GH對(duì)DCs免疫特征和功能的修飾作用是可控的,可逆的,可被生長(zhǎng)激素拮抗劑培維索孟有效拮抗。
　　 第二部分胰島素對(duì)臍血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞功能狀態(tài)及誘導(dǎo)的CTL殺傷胰腺癌細(xì)胞株的影響
　　 目的探討胰島素(insulin,In)對(duì)臍血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)的免疫功能狀態(tài)和DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity t lymp

11、hocyte,CTL)殺傷胰腺癌細(xì)胞株活性的影響。
　　 方法：從新鮮臍帶血中分離出單核細(xì)胞,應(yīng)用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)刺激單核細(xì)胞,不同濃度的In做為修飾因子修飾DCs誘導(dǎo)過(guò)程,設(shè)立空白對(duì)照組陰性對(duì)照組(氫化可的松作為修飾因子)和陽(yáng)性對(duì)照組(以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為修飾因子)；觀察DCs形態(tài)、數(shù)目、生長(zhǎng)狀態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs的免疫表型,ELISA方法測(cè)定DCs上清液中IL-12,自體

12、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定其功能狀態(tài)；In修飾后的DCs誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞成為CTL細(xì)胞,比較測(cè)定CTL對(duì)2種胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu-8988和AsPC-1的殺傷活性。
　　 結(jié)果：臍血來(lái)源的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF誘導(dǎo)和In的修飾下成功分化成為DCs,不同濃度(2.5mg/L～25mg/L)In可顯著上調(diào)DCs細(xì)胞表面HLA-DR、CD1α、CD80、CD83分子表達(dá)的陽(yáng)性率(P<0.05),明顯提高DCs分泌IL-12的

13、能力(P<0.05),DCs對(duì)自體淋巴細(xì)胞的激活功能明顯增強(qiáng)(P<0.05),經(jīng)In修飾的DCs誘導(dǎo)出的CTL細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞株的活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：.(1).In可明顯促進(jìn)DCs的誘導(dǎo)過(guò)程,修飾加速DCs的成熟并提高細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá),增強(qiáng)DCs IL-12分泌和激發(fā)自身淋巴細(xì)胞增殖能力。(2).In修飾DCs的誘導(dǎo)獲取過(guò)程,可獲得更高比例成熟型DCs細(xì)胞群,并且該DCs細(xì)胞群具有更強(qiáng)的免疫激活功