RNA干擾抑制c-Met基因表達(dá)對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞生物學(xué)行為的作用.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾抑制cMet基因表達(dá)對(duì)人喉癌Hep2細(xì)胞生物學(xué)行為的作用姓名：謝治年申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：姬長(zhǎng)友20090501第三軍醫(yī)人學(xué)碩十學(xué)位論文經(jīng)雙酶切后的載體Psilencer20U6連接，構(gòu)建攜帶此shRNA的重組質(zhì)粒pSilencer2O，cMet—shRNA，轉(zhuǎn)化DH5Q菌株，提取質(zhì)粒行酶切鑒定，并進(jìn)行序列測(cè)定。2利用構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染到喉癌Hep2

2、細(xì)胞株中。采用RTPCR及westem—Blot法檢測(cè)c—MetmRNA及蛋白表達(dá)情況，比較轉(zhuǎn)染前后其表達(dá)的變化，判斷各shRNA的干擾效應(yīng)；篩選出抑制效果最好的c—MetsiRNA序列。3通過(guò)四甲基偶氮嘩藍(lán)(MTT)法(取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)24h、48h、72h、96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn))、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)(通過(guò)構(gòu)建transwell小室)比較重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep一2細(xì)胞前后細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及侵襲能力。結(jié)果：1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5Q菌株經(jīng)氨卞青霉素

3、抗性篩選可見(jiàn)有細(xì)菌克隆長(zhǎng)出。2雙酶切鑒定顯示重組質(zhì)粒含有BamHI及HindIII酶切位點(diǎn)。3經(jīng)測(cè)序，模板序列與設(shè)計(jì)序列完全正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。4通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染三種干擾質(zhì)粒后，RTPcR法檢測(cè)cMet基因的mRNA表達(dá)水平，顯示三組均下調(diào)，以重組質(zhì)粒pSilencer2O／c—Met—shRNA2效應(yīng)最顯著(p=O003)。5經(jīng)WestemBlot法檢測(cè)，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染三種干擾質(zhì)粒后，c—Met蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)，以重組質(zhì)粒pSi

4、lencer20，cMetshRNA2效應(yīng)最顯著(p=O02)。6psilencer20／cMetshRNA2轉(zhuǎn)染Hep一2細(xì)胞后，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后的吸光度A492值均顯著下降(pO05)。7pSilencer2O／cMetshRNA2轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞后，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)為15oo36l(p值均=O004)，趨化運(yùn)動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)為7267473(分另IJ為p=

5、OOOl，p=0004)。結(jié)論：1成功構(gòu)建了針對(duì)cMet基因的重組RNAi質(zhì)粒pSilencer2O紀(jì)一Met—shRNAl、pSilencer2o／c—MetshRNA2、pSilencer2o／c—MetshRNA3。2重組質(zhì)粒pSjJencer2。O／cMet—shRNA2可明顯降低喉癌Hep2細(xì)胞cMet基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。3重組質(zhì)粒pSilencer20／c—Met—shRNA2能顯著抑制喉癌Hep一2細(xì)胞的生長(zhǎng)、