siRNA抑制cortactin基因表達(dá)對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和侵襲的影響.pdf

1、背景與目的：皮層肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白cortactin(cortical actin-binding protein)參與細(xì)胞骨架系統(tǒng)的調(diào)控、細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞黏附等過程，研究表明cortactin與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而，cortactin在喉癌中的重要作用還沒有被詳細(xì)的闡明。本實(shí)驗(yàn)探討siRNA(small interfering RNA)抑制cortactin基因表達(dá)對喉癌Hep-2細(xì)胞系體外增殖和侵襲的影響。
　　方法

2、：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建針對cortactin基因的小干擾 RNA真核表達(dá)載體pSilencer3.1-H1neo-cortactin；用DNA測序法鑒定重組質(zhì)粒；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hep-2細(xì)胞，同時(shí)以轉(zhuǎn)空載體組和空白組作為對照(三組細(xì)胞分別命名為pcortactin-siRNA/Hep-2，pSilencer3.1/Hep-2，Hep-2)，G418篩選出陽性細(xì)胞克??；應(yīng)用Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢

3、測cortactin在Hep-2中的siRNA干擾效率及定位；MTT和平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況；Transwell體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移侵襲能力。
　　結(jié)果：DNA測序分析表明針對cortactin基因的重組真核表達(dá)載體pSilencer3.1-H1neo-cortactin構(gòu)建成功。免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示cortactin在Hep-2細(xì)胞胞漿中呈彌漫性表達(dá)，Western blot顯

4、示成功構(gòu)建cortactin表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)喉癌細(xì)胞系pcortactin-siRNA/Hep-2。與空白組Hep-2細(xì)胞比較,pcortactin-siRNA/Hep-2的cortactin含量為11.22％(P＜0.01)；細(xì)胞生長速度明顯減慢（P＜0.05）；克隆形成率降低為21.47%(P＜0.01)；細(xì)胞中S期細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.05）；遷移、侵襲能力顯著降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論：1.成功建立cortact