丁酸鈉對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、喉癌是一種常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，位居頭頸部上皮源性惡性腫瘤的第2位，占全身腫瘤的1.2％～1.6％。近年來(lái)，世界多數(shù)地區(qū)喉癌的發(fā)病率及死亡率均有明顯增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。雖然近幾十年來(lái)傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、放療、化療等已有很大改進(jìn)，提高了患者的5年生存率，但手術(shù)治療往往嚴(yán)重破壞患者的喉功能而致殘；放療僅對(duì)早期喉癌療效好，對(duì)于大多數(shù)就診時(shí)即為中、晚期或治療后又出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者往往效果不佳；而化療又由于其嚴(yán)重的毒、副作用

2、常使得患者不能耐受治療，從而使這些治療方式仍受到極大限制。 近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)理研究的不斷深入，針對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制多環(huán)節(jié)而起作用的新型抗腫瘤藥物不斷發(fā)展，新的抗癌藥物不斷應(yīng)用于臨床，但因存在不少急需解決的問(wèn)題，其臨床應(yīng)用前景仍受到很大限制。而以在維持腫瘤的生長(zhǎng)中起重要作用的端粒酶為靶點(diǎn)的端粒酶抑制劑和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的凋亡誘導(dǎo)劑等，因其作用機(jī)制廣泛，潛在的毒性反應(yīng)較輕，已引起腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。 組蛋白去乙酰化酶抑

3、制劑(histone deacetylase inhibitors，HDIs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的靶向抗腫瘤藥物，它主要通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化狀態(tài)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列結(jié)果而達(dá)到治療腫瘤的目的。丁酸鈉(sodium butyrate，SB)是食物纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種無(wú)毒的四碳短鏈脂肪酸，是HDIs中的一類小分子化

4、合物。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丁酸鈉能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，并且在誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中，還能有效地抑制細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)，具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，丁酸鈉對(duì)人前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤均有明顯的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，且對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒副作用。這些研究結(jié)果提示丁酸鈉有望成為一種高效、低毒的凋亡誘導(dǎo)劑和端粒酶抑制劑在腫瘤治療中發(fā)揮作用。目前對(duì)丁酸鈉抗腫瘤作用的研究已涉及消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及

5、骨腫瘤等相關(guān)系統(tǒng)腫瘤，但丁酸鈉對(duì)頭頸部腫瘤影響的報(bào)道較少，有關(guān)其對(duì)喉癌作用的研究，迄今國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。隨著細(xì)胞培養(yǎng)方法的發(fā)展與普及，應(yīng)用體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞尋找新抗癌藥物的研究已逐漸成為最重要的初篩手段之一。Hep-2為人喉上皮樣癌細(xì)胞系，因其保留了大部分人喉鱗癌的生物學(xué)特性，己被廣泛用于喉癌診斷、治療的體外研究。 為探討丁酸鈉在喉癌治療中的作用，本研究在體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及多種分子生

6、物學(xué)技術(shù)觀察了丁酸鈉對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響并探討其發(fā)生機(jī)制，為藥物治療喉癌拓展新的思路和方法。 機(jī)體內(nèi)部環(huán)境與體外環(huán)境有著很大的差異，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能確切反映藥物在體內(nèi)對(duì)腫瘤的殺傷情況。為進(jìn)一步明確丁酸鈉經(jīng)體內(nèi)代謝后對(duì)腫瘤的影響，本研究在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Hep-2細(xì)胞株建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型，應(yīng)用適當(dāng)濃度的丁酸鈉進(jìn)行分組治療實(shí)驗(yàn)，觀察丁酸鈉的抑瘤作用以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng)，并探討其發(fā)生機(jī)制，為藥

7、物的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為以下三部分。 第一部分丁酸鈉對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響 方法 1．采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl terazolium，MTT)比色法測(cè)定經(jīng)0.625、1.25、2.5、5、10mmol/L丁酸鈉分別作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2細(xì)胞增殖活性的改變，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2．應(yīng)用透射電鏡觀察

8、經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用48h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 3．采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminaldeoxynucl-eotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL)技術(shù)分別檢測(cè)經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0(對(duì)照)、24、48、72h的細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis irldex，AI)。 4．分別

9、提取經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，顯示凋亡細(xì)胞DNA片段化。 5．采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。 6．分別制備經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞爬片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)情況。 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)

10、計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。MTT法采用兩因素方差分析加LSD法兩兩比較，TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)均采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 第二部分丁酸鈉對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達(dá)的影響 方法 1．采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(telomeric repeat amplificatiOn protocal，TRAP)-銀染法檢測(cè)經(jīng)2.5mmol/L丁酸

11、鈉作用0、24、48、72h的Hep-2細(xì)胞端粒酶活性，并應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，研究丁酸鈉對(duì)Hep-2細(xì)胞端粒酶活性的影響。 2．采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PeR)技術(shù)檢測(cè)經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h后細(xì)胞端粒酶三組分的mRNA表達(dá)情況，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，研究丁酸鈉對(duì)Hep

12、-2細(xì)胞端粒酶三組分表達(dá)的影響，以期了解丁酸鈉影響細(xì)胞端粒酶活性的作用部位。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 第三部分丁酸鈉對(duì)人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究 方法 1．選用4-6w齡BALB/C-nu/nu雌性裸小鼠12只，于裸鼠右腋部皮下接種Hep-2細(xì)胞，建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)

13、驗(yàn)組，每組6只，治療組每d向腫瘤組織局部注射丁酸鈉，劑量為2.2mg/g體質(zhì)量；對(duì)照組注射同體積PBS(0.01M，pH7.4)。共治療4w。 2．每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動(dòng)狀況。每w測(cè)量瘤體大小及裸鼠體質(zhì)量，繪制腫瘤生長(zhǎng)變化曲線，進(jìn)行藥物毒性評(píng)價(jià)。治療結(jié)束時(shí)處死小鼠，剝除腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率。光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤及心、肝、肺、脾、腎等重要臟器變化。 3．應(yīng)用透射電鏡觀察移植瘤超微結(jié)構(gòu)變化。 4．采用TUNE

14、L 法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)。 5．采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)情況，并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析。 6．采用TRAP-銀染法檢測(cè)移植瘤端粒酶活性，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。 7．采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤端粒酶三組分mRNA表達(dá)情況，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。 8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以α

15、=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)論 本文采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)以及多種分子生物學(xué)技術(shù)首次檢測(cè)了丁酸鈉對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞及人喉癌裸鼠移植瘤的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、Ki-67抗原、Survivin蛋白表達(dá)、端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達(dá)的影響，得出如下結(jié)論： 1．丁酸鈉對(duì)Hep-2細(xì)胞具有增殖抑制作用，這種抑制作用呈時(shí)間劑量依賴性。 2．丁酸鈉對(duì)Hep-2細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，這種作用存在時(shí)間依賴

16、性。 3．丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細(xì)胞Ki-67抗原表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。此作用可能是其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。 4．丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。其對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用可能是通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。 5．丁酸鈉參與Hep-2細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。丁酸鈉對(duì)細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及端粒酶抑制作用可能均與其G0/G1期阻滯有關(guān)。 6．丁酸鈉能

17、抑制Hep-2細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)，并下調(diào)其端粒酶活性，二者均呈時(shí)間依賴性；而對(duì)hTR mRNA和hTP1 mRNA表達(dá)無(wú)影響。提示丁酸鈉對(duì)Hep-2細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用可能是通過(guò)下調(diào)hTERT基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。 7．成功構(gòu)建了人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，證實(shí)丁酸鈉能抑制喉癌移植瘤生長(zhǎng)，且對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒、副作用。 8．與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，丁酸鈉能下調(diào)喉癌裸鼠移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白