2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、目的:鹿茸是一種可完全再生的哺乳動物附屬器官,被作為一種生物學(xué)模型受到廣大學(xué)者的關(guān)注,搞清鹿茸再生機制有望為人類肢體再生提供可借鑒的理論依據(jù)。生茸區(qū)骨膜細胞(APCs)與角柄骨膜細胞(PPCs)分別是鹿茸發(fā)生與再生的關(guān)鍵,均具有干細胞特性,因此也分別稱為鹿茸發(fā)生干細胞(SCAG)與鹿茸再生干細胞(SCAR)。有限的鹿茸干細胞可以在短短的兩個月內(nèi)生成完整的鹿茸組織,這在其他哺乳動物器官組織中是不可能完成的。組織器官再生源于細胞的分裂增殖,

2、細胞的分裂增殖依賴于細胞周期調(diào)控,因此對鹿茸干細胞周期的研究對揭示鹿茸再生機制具有重要意義。p21是一種細胞周期的主要調(diào)控因子,與p53共同構(gòu)成細胞周期的G1檢查點。研究發(fā)現(xiàn) p21單基因敲除使普通小鼠獲得了同 MRL小鼠一樣閉合耳洞的能力,同時相關(guān)再生細胞具有特殊的細胞周期分布(G2/M阻滯),很多再生模型中也都發(fā)現(xiàn)了相同的G2/M積聚現(xiàn)象。但檢測鹿茸干細胞周期,沒有發(fā)現(xiàn)特殊的G2/M期阻滯(未發(fā)表),推測可能與p21基因有關(guān),為證明

3、這一假設(shè),并探討p21基因在鹿茸再生中的作用,本實驗通過RNA干擾技術(shù)來研究沉默p21基因?qū)β谷赘杉毎飳W(xué)特性的影響。
  方法:1、利用在線設(shè)計軟件與通用RNAi設(shè)計法則篩選出針對東北梅花鹿p21基因的RNAi高分靶位點,化學(xué)合成并體外退火,與載體質(zhì)粒PLVTHM重組,通過PCR鑒定及測序鑒定篩選出陽性質(zhì)粒。2、重組質(zhì)粒與pMD2.G、pCMV-dr8.9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293t細胞,收集并濃縮含有目的基因的慢病毒載體。慢病毒感染

4、,流式細胞儀分選陽性細胞,Q-PCR檢測轉(zhuǎn)染后PP細胞中mRNA表達量。3、MTT法檢測細胞在傳代早期與后期的增殖速率;流式細胞法檢測細胞周期與細胞凋亡;β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老;彗星電泳實驗檢測細胞DN A損傷。
  結(jié)果:1、成功篩選了2條針對東北梅花鹿P21基因的RNAi高分靶位點并化學(xué)合成,體外退火獲得雙鏈寡核苷酸鏈;2、與載體質(zhì)粒PLVTHM連接,成功獲得重組質(zhì)粒;3、通過三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293t細胞,成功獲得大量慢

5、病毒粒子;4、通過感染PP細胞并分選,獲得穩(wěn)定感染的細胞株;5、RT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染細胞p21基因mRNA表達量顯著降低;6、對感染后細胞生物學(xué)特性檢測發(fā)現(xiàn):傳代早期細胞增殖速率無顯著變化,傳代后期細胞增殖速度明顯高于對照組;細胞周期無顯著變化;細胞凋亡數(shù)顯著增多;細胞衰老被抑制;細胞DN A損傷明顯增加。
  結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了針對東北梅花鹿p21基因的慢病毒表達載體,并獲得了p21基因沉默的穩(wěn)定PP細胞株,為p21基因

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